Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 16
1.1. Этиологическое значение Pseudomonas aeruginosa и разнообразие нозологических форм синегнойной инфекции 16
1.2. Микробиологическая характеристика P. aeruginosa 23
1.2.1. Общая характеристика микроорганизма 23
1.2.2. Продукция факторов патогенности и антибактериальных веществ 24
1.2.3. Подвижность и пленкообразующая способность 35
1.2.4. Pseudomonas aeruginosa в планктонной и пленочной смешанной культуре in vitro (антагонистическая активность) 39
1.2.5. Влияние экзопродуктов P. aeruginosa на функциональную активность нейтрофилов 41
1.2.6. Распространенность фенотипов резистентности 42
1.2.6.1. Молекулярная эпидемиология бактерий P. aeruginosa, продуцирующих карбапенемазы 44
1.3. Методы микробиологического анализа для идентификации, типирования и оценки патогенного потенциала Pseudomonas aeruginosa 47
1.3.1. Бактериологический метод 47
1.3.2. Молекулярные технологии, используемые для генотипической характеристики Pseudomonas aeruginosa 50
1.3.2.1. Идентификация и прямая детекция 50
1.3.2.2. Методы генетического типирования 53
1.3.3.1. Генотипы вирулентности и антибиотикоустойчивости 58
Экспериментальная часть
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 64
2.1. Анализ медицинской документации 64
2.2. Бактериальные штаммы 65
2.3. Среды и условия культивирования 66
2.4. Молекулярно-генетические исследования 67
2.4.1. Идентификация/детекция бактерий 68
2.4.2. Генетическая детерминация эффекторов TTSS 69
2.4.3. Определение детерминант антибиотикоустойчивости 70
2.4.4. Проведение секвенирующей реакции 72
2.4.5. Методы генетического типирования 72
2.5. Фенотипические методы определения факторов патогенности 73
2.5.1. Определение степени гидрофобное поверхности бактериальных клеток (ВАТН-тест) 73
2.5.2. Определение адгезивных свойств 73
2.5.3. Определение биопленкообразующей способности 74
2.5.4. Определение экзопродуктов 75
2.5.5. Определение гемолитической активности 76
2.6. Фенотипическая оценка антибиотикоустойчивости 77
2.7. Оценка интенсивности биолюминесценции 77
2.8. Экстракция АТФ из клеток в составе биопленок и определение концентрации внутриклеточного АТФ 78
2.9. Экспериментальные процедуры по изучению антагонистической активности P. aeruginosa и
оценке ее роли в межвидовых взаимоотношениях 78
2.9.1. Оценка антагонистической активности супернатантов P. aeruginosa 78
2.9.2. Определение токсичности супернатантов P. aeruginosa 78
2.9.3. Оценка влияния супернатантов P. aeruginosa на планктонные и биопленочные культуры Е. coli 79
2.9.4. Совместное культивирование P. aeruginosa и Е. coli 79
2.10. Оценка апоптоза/некроза нейтрофилов 80
2.11. Микроскопические методы оценки биопленок (атомно-силовая и лазерная сканирующая конфокальная микроскопия) 81
2.12. Статистические методы 81
ГЛАВА 3. Мониторинг pseudomonas aeruginosa в стационарах различного профиля взрослой и педиатрической медицинской сети 83
3.1. Инфицированность пациентов и частота встречаемости P. aeruginosa в спектре микробных
культур 83
3.2. Распространенность P. aeruginosa в стационарах хирургического профиля 86
3.2.1. Частота выделения P. aeruginosa от пациентов, госпитализированных в хирургические стационары различного профиля 86
3.2.2. Характеристика антибиотикоустойчивости изолятов P. aeruginosa 90
3.2.3. Микробные ассоциации с участием P. aeruginosa при гнойно-септических осложнениях у пациентов стационаров хирургического профиля 94
3.2.4. Роль P. aeruginosa в этиологии инфицированных ожоговых ран 96
3.3. Особенности циркуляции P. aeruginosa в акушерских стационарах 99
ГЛАВА 4. Молекулярные методы в идентификации/детекции, типировании и оценке клинической значимости нозокомиальных штаммов p. aeruginosa 105
4.1. Сравнительный анализ применения культурального и молекулярно-генетического методов
для определения видовой принадлежности P. aeruginosa 105
4.2. Применение ПЦР-анализа для контроля обсемененности объектов внешней среды 111
4.3. Генотипирование нозокомиальных культур P. aeruginosa 112
4.3.1. Сравнительная оценка диагностической значимости RAPD- и Rep-ПЦР при генотипировании клинических изолятов P. aeruginosa 112
4.3.2. Эпидемиологическая характеристика (основные геномоварианты) P. aeruginosae, циркулирующих в ЛПУ различного профиля 117
4.3.3. Генетическое разнообразие ЫаОхА-50-Ше как основа выявления родства изолятов P. aeruginosa 120
4.4. Молекулярные механизмы устойчивости нозокомиальных штаммов P. aeruginosa к бета-
лактамным антибиотикам 123
4.4.1. Распространенность оксациллиназ с БЛРС-фенотипом 123
4.4.2. Поиск и изучение генов, кодирующих металло-бета-лактамазы 125
4.5. Генетические профили цитотоксичности штаммов P. aeruginosa 131
4.6. Использование мультилокусной ПЦР-тест системы в оценке клинико-эпидемиологической значимости изолятов P. aeruginosa 133
ГЛАВА 5. Характеристика биологических свойств нозокомиальных штаммов p. aeruginosa 136
5.1. Разнообразие фенотипов клинических штаммов P. aeruginosa 136
5.2. Оценка пигментообразования штаммами P. aeruginosa 138
5.3. Комплексная оценка гемолитической активности P. aeruginosa 139
5.3.1. Внеклеточные факторы гемолитической активности 140
5.3.2. Клеточно-ассоциированный гемолиз 141
5.4. Особенности формирования биопленок нозокомиальными штаммами P. aeruginosa 146
5.4.1. Взаимосвязь гидрофобных свойств поверхности, адгезивной активности и биопленкообразующей способности клеток бактерий 146
5.4.2. Биопленкообразующая способность как маркер госпитальности клинических изолятов 155
5.5. Оценка потенциальной патогенности клинических штаммов P. aeruginosa биолюминесцентным методом 157
5.6. Модификация биологических свойств клинических штаммов P. aeruginosa при многократных пересевах и хранении на искусственных питательных средах 164
ГЛАВА 6. Характеристика симбиотических/антагонистических взаимоотношений p. aeruginosa и клинически значимых упм в планктоне и биопленке (in vitro) 170
6.1. Изучение межвидовых взаимодействий нозокомиальных штаммов в биопленках 170
6.1.1. Влияние супернатантов УПМ на пленкообразующую способность P. aeruginosa 170
6.1.2. Формирование смешанных биопленок P. aeruginosa с представителями других таксонов УПМ 172
6.2. Влияние экзометаболитов P. aeruginosa на планктонные и пленочные культуры E. coli 173
6.3. Характер взаимоотношений P. aeruginosa и E. coli при совместном культивировании в планктоне и биопленке 179
6.4. Влияние супернатантов смешанной культуры P. aeruginosa и E. coli на апоптоз, некроз и окисислительную активность нейтрофилов in vitro 179
Заключение 193
Выводы 205
Практические рекомендации 207
Список условных сокращений 208
Список литературы 209
