Введение
I. Обзор литературы 10
1.1. Полимеразная цепная реакция 10
1.1.1. Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией 11
1.1.2. Методы детектирования продуктов ПЦР
1.2. Микрочиповые технологии в аналитической практике и в методе ПЦР 18
I.2.1. Особенности использования микрочиповых технологий для проведения ОТПЦР. 20
1.3. Способы модифицирования и пассивации поверхности алюминиевых ОТПЦР микрочипов и методы исследования полученных пленок
1.3.1. Классические методы обработки поверхности алюминиевых изделий . 22
1.3.2. Плазмохимическое осаждение пленок из газовой фазы .23
1.3.3. Механизмы плазмохимического осаждения 24
1.3.4. Основные реакции ПХО, используемые для модификации поверхности алюминия.. 26
1.3.5. Электрохимическая импедансная спектроскопия для оценки инертности пленок на поверхности металлов .28
1.3.6. Исследование морфологической структуры пленок методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) с последующим рентгеноспектральным микроанализом 33
1.3.7. Оценка структуры покрытий методом спектроскопии комбинационного рассеяния (Raman) .34
1.4. Иммобилизация ПЦР реактивов на поверхности пробирок и микрофлюидных устройств .35
1.4.1. Лиофилизация как метод сушки биологически активных веществ: принцип, преимущества и недостатки 36
1.4.2. Основные особенности лиофилизации белков 39
1.4.3. Основные стабилизаторы для ПЦР компонентов 42
1.4.4. Особенности применения метода лиофилизации для ПЦР-реактивов 45
I.5 Методы выделения нуклеиновых кислот
1.5.1. Классические методы выделения нуклеиновых кислот 46
1.5.2. Выделение нуклеиновых кислот с помощью магнитных частиц 47
I.6. Основные сведения о болезни Ньюкасла и Инфекционном бронхите кур
1.6.1. Классические методы определения вирусов НБ и ИБК 52
1.6.2. Иммуноферментный метод определения вирусов НБ и ИБК 54
II. Аппаратура, методики и техника экспериментов
11.1. Топология и устройство алюминиевого микрочипа 56
11.2. Изготовление алюминиевого микрочипа..
2.1. Оборудование для изготовления микрочипов. 57
11.2.2. Реактивы для изготовления микрочипов 57
11.2.3. Стадия 1: предварительная подготовка поверхности алюминиевой подложки 58
11.2.4. Стадия 2: плазменная обработка алюминиевой подложки 58
11.2.5. Стадия 3а: гидрофилизация поверхности алюминиевой подложки 58
11.2.6. Стадия 3б: Гидрофобизация внешней (между микрореакторами) поверхности алюминиевой подложки 59
11.2.7. Стадия 4: соединение готовой алюминиевой подложки с пластмассовой рамкой 59
11.3. Плазмохимическое осаждение покрытий на поверхности алюминиевой пластины и методы
исследования полученных пленок 60
II.3.1. Оборудование и реактивы для ПХО .60
11.3.2. Методика проведения ПХО на поверхности алюминиевых микрочипов .61
11.3.3. Исследование инертности покрытий в условиях ПЦР методом спектроскопии электрохимического импеданса .63
11.3.4. Измерение угла смачивания поверхности микрочипов водой методом растекающейся капли .64
11.3.5. Исследование морфологической структуры и оценка элементного состава пленок методами сканирующей электронной микроскопии и рентгеновского энергодисперсионного микроанализа 65
II.3.6. Исследование структуры пленок методом спектроскопии комбинационного рассеяния (Raman) 66
11.4. Методы пробоподготовки биологического материала .66
11.4.1. Выделение РНК из биологического материала с помощью коммерческого комплекта реагентов "АмплиПрайм РИБО-преп" .67
11.4.2. Выделение РНК из биологического материала с помощью комплекта реагентов "АмплиПрайм РИБО-сорб" 68
11.4.3. Выделение РНК из биологического материала с помощью магнитных частиц .70
11.5. Проведение ОТПЦР с помощью микрочипового анализатора AriaDNA 73
11.5.1. Проведение ОТПЦР на жидких реактивах .73
11.5.2. Проведение ОТПЦР c иммобилизированными реактивами .75
11.6. Иммобилизация ОТПЦР-реагентов внутри микрореакторов алюминиевого микрочипа с
помощью экспериментальной лиофильной установки .76 11.6.1. Экспериментальная установка для иммобилизации ОТПЦР реактивов .76
11.6.2. Методика приготовления растворов стабилизаторов 78
11.6.3. Приготовление полной смеси ПЦР- и ОТПЦР-реактивов для лиофилизации .79
11.6.4. Методика иммобилизации реактивов внутри ячеек алюминиевого микрочипа 79
11.6.5. Методика искусственного старения микрочипов с иммобилизированными реагентам 80
II.7. Исследование морфологической структуры лиофильных пленок методом сканирующей электронной микроскопии 81 III. Результаты плазмохимического осаждения пленок на поверхности алюминиевых микрочипов 82
111.1. Оценка инертности углеродсодержащих покрытий в условиях ПЦР 83
111.2. Исследование углеродсодержащих пленок с помощью спектроскопии электрохимического импеданса .87
111.3. Исследование морфологических свойств покрытий методом сканирующей электронной микроскопии и оценка состава полученных пленок методом рентгеновской
энергодисперсионной спектроскопии 90 III.4.Оценка состава покрытия методом спектроскопии комбинационного рассеяния
(Raman) 96
III.5.Измерение контактного угла смачивания поверхности микрочипов водой .98 III.6.Проведение ОТПЦР на микрочипах с нанесенными углеродсодержащими пленками с использованием микрочипового ПЦР-анализатора 99
IV. Подбор оптимальных физических условий для иммобилизации ПЦР реагентов на поверхности алюминиевых микрочипов на примере ДНК-систем 102
IV.1. Оптимизация методики модификации поверхности подложки микрочипа .102
IV.2. Оптимизация условий для экспериментальной установки для иммобилизации реактивов 105
IV.3. Оптимизация времени лиофилизации ПЦР-реагентов в экспериментальной установке 107
IV.4. Сравнение методов иммобилизации ПЦР-реагентов на поверхности алюминиевых микрочипов .108
IV.5. Проверка длительности хранения лиофилизированных реактивов для ПЦР-анализа проб .112
V.Иммобилизация ОТПЦР реактивов в микрореакторах алюминиевого микрочипа .114 V.1.Исследование влияния процесса лиофилизации на активность ревертазы 114
V.2 Исследование влияния модельной смеси стабилизаторов на ОТПЦР реактивы в жидкой форме 117
V.3.Результаты лиофилизации ОТПЦР-реактивов с модельной смесью стабилизаторов 122
V.4 Исследование эффективности стабилизации иммобилизированных ОТПЦР-реактивов в
зависимости от времени хранения 127
V.5 Исследование стабилизации положительного РНК контроля в процессе искусственного
старения 132
VI. Оптимизация пробоподготовки вирусных пассажей на курином эмбрионе 137
VI.1. Оптимизация температуры и времени лизиса клеток для схемы пробоподготовки на
основе суспензии магнитного сорбента 138
VI.2 Оптимизация стадии сорбции РНК на поверхности магнитного сорбента 142
VI.3. Очистка сорбента от гидрофильных и гидрофобных ингибиторов 143
VI.4. Оптимизация стадии элюирования РНК с магнитного сорбента 146
Выводы 152
Перечень используемых сокращений 153
Литература
