Введение
I. Обзор литературы 19
1.1. Принципы современной клинической диагностики онкологических заболеваний 19
1.2. Опухолевые маркеры 21
1.2.1. Ассоциированные с опухолью антигены – классические онкомаркеры 21
1.2.2. Индивидуальные онкомаркеры 24
1.2.2.1. Простатический специфический антиген 24
1.2.2.2. Раковоэмбриональный антиген 27
1.2.2.3. Опухолевый антиген СА 15-3 28
1.2.2.4. Опухолевый антиген СА 125 30 1.3. Флуоресцентные нанокристаллы для многопараметрического анализа 32
1.3.1. Характеристика и свойства полупроводниковых флуоресцентных нанокристаллов 32
1.3.2. Области применения флуоресцентных нанокристаллов и перспективы использования в клинической диагностике 39
1.3.2.1. Иммуноцитохимия и иммуногистохимия с использованием биоконъюгатов на основе флуоресцентных нанокристаллов 39
1.3.2.2. Многоцветная проточная цитофлуориметрия с использованием биоконъюгатов на основе флуоресцентных нанокристаллов 45
1.3.2.3. Мониторинг внутриклеточных процессов и взаимодействий с помощью биконъюгатов на основе флуоресцентных нанокристаллов 48
1.3.3. Многопараметрические суспензионные системы на основе оптически кодированных микросфер 52
1.3.4. Преимущества суспензионных систем на основе микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами 62
1.4. Заключение 64
II. Материалы и методы 66
2.1. Коллекция образцов сыворотки крови человека 66
2.2. Анализ образцов сыворотки крови с помощью традиционного иммуноферментного метода 67
2.3. Получение стабильных водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов 68
2.3.1. Солюбилизация флуоресцентных нанокристаллов цистеином .68
2.3.2. Модификация поверхности флуоресцентных нанокристаллов производным полиэтиленгликоля 69
2.3.3. Очистка модифицированных флуоресцентных нанокристаллов 70
2.4. Оптическое кодирование микросфер флуоресцентными нанокристаллами 71
2.4.1. Подготовка поверхности микросфер 71
2.4.2. Кодирование микросфер водорастворимыми флуоресцентными нанокристаллами 72
2.5. Характеризация микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами 2.6. Конъюгация распознающих биомолекул с поверхностью флуоресцентных микросфер 76
2.7. Биотинилирование детекторных моноклональных антител 79
2.8. Многопараметрический иммуноанализ образцов сыворотки крови с помощью флуоресцентных микросфер в суспензии 80
2.8.1. Количественная детекция свободного и общего ПСА в образцах сыворотки крови 82
2.8.2. Количественная детекция СА 15-3, РЭА и СА 125 в образцах сыворотки крови 84
2.9. Определение аналитических характеристик суспензионной
системы на основе флуоресцентных микросфер 86
2.9.1. Воспроизводимость анализа 86
2.9.2. Аналитическая чувствительность 86
2.9.3. Определение линейного диапазона определяемых концентраций (тест на линейность) 87
2.9.4. Оценка достоверности определения концентрации онкомаркеров в смешанных образцах сыворотки (тест на «открытие») 88
2.10. Статистическая обработка результатов 89
III. Результаты и их обсуждение 90
3.1. Получение стабильных водорастворимых флуоресцентных нанокристаллов 90
3.2. Оптическое кодирование микросфер флуоресцентными нанокристаллами 94
3.3. Характеризация микросфер, кодированных флуоресцентными нанокристаллами 103
3.4. Количественная детекция свободного и общего ПСА в образцах сыворотки крови с помощью флуоресцентных микросфер 108 3.4.1. Микросферы с адаптерными молекулами на поверхности 110
3.4.2. Антиген-специфические микросферы с распознающими антителами на поверхности 113
3.5. Диагностические характеристики суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер: регрессионный анализ 118
3.6. Аналитические характеристики суспензионной системы на основе флуоресцентных микросфер 121
3.6.1. Воспроизводимость анализа 122
3.6.2. Аналитическая чувствительность 125
3.6.3. Линейный диапазон определяемых концентраций 125
3.6.4. Достоверность определения концентрации онкомаркеров в смешанных образцах сыворотки 128
3.7. Принципы количественной детекции СА 15-3, РЭА и СА 125 в образцах сыворотки крови с помощью флуоресцентных микросфер 130
Заключение 136
Выводы
