Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 8
1.1. Репрограммирование ядра соматической клетки 8
1.2. Генетическое репрограммирование соматических клеток до плюрипотентного состояния 9
1.3. Возможности дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в нейроны 11
1.4. Использование генетического репрограммирования для изучения и лечения нейродегенеративных заболеваний 12
1.5. Болезнь Альцгеймера 14
1.6. Шизофрения 15
1.7. Боковой амиотрофический склероз 16
1.8. Болезнь Паркинсона 17
1.9. Болезнь Гентингтона 18
1.10. Перспективы моделирования болезни Гентингтона с помощью ИПСК 21
ГЛАВА 2. Материалы и методы 22
2.1. Клеточный материал 22
2.2. Культивирование фибробластов 22
2.3. Получение культуры фибробластов из биоптатов кожи человека 22
2.4. Замораживание и оттаивание клеток 23
2.5. Культивирование ЭСК и ИПСК человека в бесфидерных условиях 23
2.6. Культивирование ЭСК и ИПСК человека на фидере 23
2.7. Приготовление фидера 23
2.8. Покрытие желатином культуральной посуды 24
2.9. Сборка лентивирусов
2.10. Инфекция клеток лентивирусными векторами 25
2.11. Определение титра лентивирусов 25
2.12. Получение ИПСК 25
2.13. Окраска антителами клеточных культур 26
2.14. Агарозный гель-электрофорез нуклеиновых кислот 27
2.15. Выделение хромосомной ДНК 27
2.16. Выделение плазмидной ДНК 27
2.17. Выделение тотальной РНК из клеточных культур 28
2.18. Реакция обратной транскрипции з
2.19. Полимеразная цепная реакция 28
2.20. Приготовление препаратов метафазных хромосом ЭСК и ИПСК человека 30
2.21. GTG-дифференциальное окрашивание 31
2.22. Формирование эмбриоидных телец 31
2.23. Культивирование эмбриоидных телец 31
2.24. Спонтанная дифференцировка ЭСК и ИПСК 31
2.25. Тест на формирование тератом 32
2.26. Дифференцировка ПСК человека в серединные шипиковые нейроны стриатума 32
2.27. Культивирование нейрональных предшественников 33
2.28. Электронная микроскопия 33
2.29. Fura-2 кальциевый имэджинг 34
2.30. Электрофизиологические исследования 34
2.31. Проточная цитометрия клеток, окрашенных Lysotracker 35
2.32. Химические вещества для количественных экспериментов 35
2.33. Количественный анализ формы клеточных ядер 36
2.34. Количественный анализ гибели клеток 36
2.35. ВЭЖХ анализ секреции ГАМК 37
2.36. Клонирование фрагментов ДНК в плазмидный вектор 37
2.37. Секвенирование фрагментов ДНК по Сэнгеру 37
2.38. Полнотранскриптомный анализ экспрессии генов 37
2.39. Статистический анализ 38
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 39
3.1. Оптимизация генетического репрограммирования соматических клеток человека 39
3.2. Получение фибробластов кожи от пациентов с хореей Гентингтона с малым количеством избыточных повторов в мутантном аллеле гена хантингтина 41
3.3. Проведение генетического репрограммирования фибробластов кожи пациентов с болезнью Гентингтона 42
3.4. Молекулярная характеристика ИПСК 44
3.5. Функциональная характеристика ИПСК 46
3.6. Характеристика набора клеточных линий для моделирования болезни Гентингтона 47
3.7. Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток человека в клетки, имеющие характеристики серединных шипиковых нейронов стриатума 48
3.8. Проявления болезни Гентингтона в мутантных серединных шипиковых нейронах стриатума, дифференцированных из ИПСК человека in vitro 53
3.9. Количественный анализ содержания лизосом в нормальных и патологических нейронах 3.10. Количественный анализ деформации ядерной оболочки внутрь клеточного ядра (инвагинация) в нейронах, полученных из ИПСК пациентов с болезнью Гентингтона и контрольной группы 56
3.11. Исследование природы инвагинаций ядерной оболочки 58
3.12. Транскриптомный анализ дифференцированных in vitro нейронов человека, полученных из ИПСК пациентов с болезнью Гентингтона и контрольных ПСК 60
3.13. Депо-управляемый вход кальция в нормальных и патологических нейронах 63
3.14. Изучение действия потенциального лекарства от болезни Гентингтона EVP4593 на фенотипические проявления болезни в нейронах, дифференцированных из ИПСК 67
3.15. Моделирование старения нейронов 68
3.16. Изучение действия потенциальных лекарств от болезни Гентингтона на модели стареющих нейронов 69
Заключение 74
Выводы 76
Список сокращений 77
Список публикаций 78
Благодарности 81
Список литературы
