Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Белки внеклеточного матрикса млекопитающих 10
2.2. Внеклеточный матрикс беспозвоночных 13
2.3. Внеклеточный матрикс кожи человека 15
2.3.1. Структура и состав кожи человека 15
2.4. Матриксные металлопротеиназы 18
2.5. Матриксные металлопротеиназы кожи человека 27
2.6. Раневой экссудат как естественное окружение клеток в ране 30
2.7. Действие матриксных металлопротеиназ на другие субстраты .33
2.8. Целомоциты беспозвоночных и их функции 34
3. Материалы и методы 39
3.1. Клетки и клеточные культуры 39
3.1.1. Фибробласты линии balb/3t3 clone a31 39
3.1.2. Клетки линии nctc clone 929 39
3.1.3. Кератиноциты человека 39
3.1.4. Эмбриональные фибробласты легкого человека 40
3.1.5. Целомоциты морской звезды asteriasrubens 40
3.2. Антитела 40
3.3. Белки внеклеточного матрикса 40
3.3.1. Ламинин-1 41
3.3.2. Ламинин-2/4 41
3.3.3. Фибронектин 41
3.4. Отбор проб раневого экссудата 42
3.5. Электрофорез 43
3.6. Зимография 43
3.7. Ингибирование ферментативного расщепления желатина при определении типа протеаз 43
3.8. Определение функциональной активности клеток в присутствии экссудата или фракций целомическои жидкости 44
3.8.1. Пролиферация 44
3.8.2. Контракция монослоя клеток 44
3.8.3. Миграционная способность клеток 44
3.9. Колориметрическое определение количества клеток с помощью мтт 45
3.10. Расщепление белков внеклеточного матрикса протеазами экссудатов 45
3.11. Получение целомической жидкости и целомоцитов морских беспозвоночных 45
3.12. Моделирование раны на морских беспозвоночных и изучение изменения состава целомической жидкости и целомоцитов после нанесения раны 46
3.13. Фракционирование белков целомической жидкости морской звезды 46
3.14. Биологическое действие белковых фракций целомической жидкости 47
3.15.иммуноблоттинг 47
3.16. Количественное определение фибронектина методом иммуноблоттинга 48
3.17. Определение матриксных металлопротеиназ в целомоцитах способом иммунофлуоресценции 48
3.18. Определение фибронектина в целомоцитах способом иммунофлуоресценции 49
3.19. Выделение фибронектино-подобного белка методом аффинной хроматографии 49
3.20. Программное обеспечение 49
4. Результаты 50
4.1. Методика отбора раневого и ожогового экссудатов 50
4.2. Выявление протеолитическои активности и определение типа протеаз в раневых экссудатах 50
4.3. Изучение протеолитическои активности раневого экссудата из острых хирургических ран 53
4.4. Изучение протеолитическои активности ожогового экссудата 54
4.5. Действие экссудата на белки внеклеточного матрикса 55
4.6. Динамика содержания белка в ожоговом экссудате 57
4.7. Содержание фибронектина в раневом экссудате 59
4.8. Влияние экссудата на функциональную активность клеток 60
4.8.1. Пролиферация 61
4.8.2. Контракция монослоя клеток линии зтз/вalb 64
4.8.3. Кератиноциты человека 67
4.8.4. Миграционная способность клеток 68
4.8.5. Изменение миграционной активности клеток под действием экссудатов, взятых на разных сроках после повреждения ткани (1-е, 3-й и 5-е сутки) 73
4.9. Изменение состава целомическои жидкости и целомоцитов морских звезд при повреждении тканей 76
4.10. Изменение протеолитической активности целомическои жидкости при повреждении ткани 77
4.11. Фракционирование белков целомическои жидкости морской звезды 78
4.12. Биологическая активность фракций целомическои жидкости морской звезды 81
4.13. Получение фибронектино-подобного белка из целомическои жидкости способом аффинной хроматографии и изучение адгезивных свойств этого белка 83
4.14. Фракции целомическои жидкости, обладающие желатинолитической активностью 84
4.15. Действие белковых фракций целомическои жидкости морской звезды на клетки линии l-929 85
4.16. Изменение миграционной активности клеток линии l-929
под действием получені 1ых фракций целомическои жидкости 89
4.17. Определение матриксных металлопротеиназ в целомоцитах интактных и травмированных морских звезд 91
4.18. Определение фибронектина в целомоцитах интактных и травмированных морских звезд 93
Обсуждение 95
Выводы 114
Список литературы 115
