Введение
2. Обзор литературы 10
2.1. Введение 10
2.1.1. Метаболизм фенилаланина в норме 10
2.1.2. Нарушение метаболизма фенилаланина как причина фенилкетонурии 12
2.1.3. Материнская фенилкетонурии 15
2.1.4. Современная классификация форм фенилкетонурии 15
2.2. Распространенность фенилкетонурии 17
2.3. Структура фенилаланингидроксилазы 20
2.4. Структура гена ФАГ 22
2.5. Мутации гена ФАГ 23
2.6. Влияние мутаций гена фенилаланингидроксилазы на проявления фенилкетонурии 25
2. б. 1. Моделирование влияния мутаций гена ФАГ на структуру фенилаланингидроксилазы 26
2.6.2. Экспрессия in vitro как метод исследования эффекта мутаций на активность ФАГ. 30
2.6.3. Модель общего механизма влияния мутаций гена ФАГ. 34
2.7. Нейтральные полиморфизмы и гаплотипы гена ФАГ, популяционная генетика фенилкетонурии 36
2.7.1. Исследование полиморфизма сайтов рестрикции гена ФАГ 37
2.7.2. Исследование полиморфизма STR и VNTR повторов гена ФАГ 38
2.7.3. Исследование происхождениямутантных аллелей 41
2.8. Перспективные подходы к терапии фенилкетонурии 43
2.8.1. Диетотерапия 43
2.8.2. Генотерапия фенилкетонурии 44
2.8.3. Медикаментозная терапия фенилкетонурии 46
3. Материалы и методы 49
3.1. Материалы 49
3.2. Методы 51
3.2.1. Обследованная группа. 51
3.2.2. Консервирование крови 52
3.2.3. Выделение геномной ДНК из крови по Muller 53
3.2.4. Полимеразная цепная реакция 54
3.2.4.а) ПЦР районов гена ФАГ. 54
3.2.4.6) РеПЦР STR и VNTR гена ФАГ 55
3.2.5. Электрофорез в агарозном геле 55
3.2.6. Электрофорез в полиакриламидном геле 56
3.2.7. Очистка продуктов ПЦР 57
3.2.7.а) Очистка продуктов ПЦР сорбцией на стекловолокне 57
3.2.7.6) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках Centrisep Spin Columns 58
3.2.7.в) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G-5058
3.2.7.г) Гелъфилътрация продуктов ПЦР на колонках с сорбентом Sephadex G-100 59
3.2.8. Реакция Сэнгера 59
3.2.9. Очистка продуктов реакции Сэнгера 60
3.2.10. Фрагментный анализ продуктов ПЦР на автоматических генных анализаторах 60
3.2.10. а) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных нуклеозидтрифосфатов 60
3.2.10.6) Фрагментный анализ продуктов ПЦР с использованием флуоресцентно меченных праймеров 61
3.2.10.в) Спектральная калибровка генных анализаторов для выполнения фрагментного анализа 62
3.2.10. г) Определение поправки между реальными и наблюдаемыми при фрагментном анализе размерами 63
3.2.11. Компьютерная обработка данных 65
3.2.11.а) Анализ электрофореграмм 65
3.2.11.6) Анализ секвенограмм автоматических генных анализаторов 65
3.2.11.в) Анализ электрофореграмм при фрагментном анализе 65
4. Результаты и обсуждение 66
4.1. Полиморфизм гена фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией
Западной Сибири Алтайского края и Саратовской области 66
4.1.1. Спектр и частота мутаций гена ФАГ, обуславливающих фенилкетонурию в Новосибирской, Кемеровской, Саратовской областях и Алтайском крае 66
4.1.2. Минигаплотипы гена ФАГ, ассоциированные с мутациями, обуславливающими ФКУ в Западной Сибири и Саратовской области 77
4.2. Рекуррентное возникновение мутации гена фенилаланингидроксилазы Y168H 85
4.3. Пренатальная диагностика фенилкетонурии в семьях больных фенилкетонурией 94
4.4. Универсальный метода идентификации однонуклеотидных замен 99
Выводы 107
Список цитированной литературы:
