Введение
Глава 1. Сибирская язва: молекулярные механизмы инфекции и подходы к лечению. Обзор литературы 6
1.1 Болезнь Сибирская язва 6
1.1.1 Патогенез 6
1.1.2 Факторы вирулентности 7
1.1.2.1 ПА 8
1.1.2.2 ЛФ 8
1.1.2.3 ОФ 9
1.1.3 Токсины СЯ 10
1.1.4 Проникновение токсинов в клетку 10
1.1.4.1 Рецепторы 10
1.1.4.2 Сборка и транслокация токсинов 12
1.1.5 Действие токсинов внутри клетки 13
1.1.5.1. Расщепление МАРКК киназ с помощью ЛФ 13
1.1.5.2 Повышение уровня цАМФ с помощью ОФ 15
1.1.6 Клеточные мишени для токсинов СЯ 16
1.1.6.1 Токсины СЯи врожденный иммунитет 16
1.1.6.1.1 ЛТ и апоптоз макрофагов 16
1.1.6.1.2 ЛТ блокирует активацию макрофагов 18
1.1.6.1.3 ЛТ и нейтрофилы 18
1.1.6.1.4 Токсины СЯ и дендритные клетки 19
1.1.6.2 Токсины СЯи приобретенный иммунитет 19
1.1.6.2.1 Токсины СЯ и ДК 20
1.1.6.2.2 Токсины СЯ и Т-клетки 20
1.1.6.2.3 Токсины СЯиВ-клетки 20
1.1.6.3 Действие токсинов нанеимунные клетки 21
1.1.6.3.1 Токсины СЯ и эндотелиальные клетки 21
1.1.6.3.2 Токсины СЯ и эритроциты 21
1.1.7 Современные подходы к лечению болезни СЯ 22
1.1.7.1 Вакцины 22
1.1.7.2 Антибактериальные лекарства 24
1.1.7.3 Антитоксины 24
1.1.7.3.1 Антитела к токсинам СЯ 24
1.1.7.3.2 Свободные рецепторы 25
1.1.7.3.3 Блокирование созревания и сборки токсинов 25
1.1.7.3.4 Предотвращение транслокации токсинов 26
1.1.7.3.5 Использование аналогов субстратов в качестве антитоксинов 27
1.1.7.3.6 Низкомолекулярпые ингибиторы эффекторных субъединиц 27
1.2 Методические подходы к получению ингибиторов металопротеаз, имеющих медицинское значение 29
1.2.1 Структура активного центра ЛФ. Дизайн ингибиторов с помощью структурных исследований 30
1.2.2 Дизайн ингибиторов с помощью ЯМР 33
1.2.3 Дизайн ингибиторов с помощью масс-спектроскопии 33
1.2.4 Селекция ингибиторов с помощью био-неорганического подхода 34
1.2.5 Механизм действия металл опротеаз. Дизайн ингибиторов на основе информации о механизме работы фермента 36
1.2.6 Получение ингибиторов путем широкомасштабного скрининга на основе активности фермента 39
1.2.6.1 Подбор эффективного субстрата для измерения активности протеазы 40
1.2.6.1.1 Использование специфичных субстратов протеаз 40
1.2.6.1.2 Подбор субстрата комбинаторным способом 41
1.2.6.1.2.1 Контекст-зависимые субстратные библиотеки 41
1.2.6.1.2.1 Смешанные контекст-зависимые библиотеки субстратов 42
1.2.6.1.2.3 Анализ библиотек пептидных субстратов методом секвенирования. 43
1.2.6.1.2.4 Иммобилизованные субстратные библиотеки 44
1.2.6.1.2.5 Сканирующие синтетические комбинаторные библиотеки 45
1.2.6.1.2.6 Субстратный фаговый дисплей 45
1.2.6.1.2.7 Другие стратегии биологического субстратного дисплея 48
1.2.6.2 Создание системы детекции активности протеазы для широкомасштабного
скрининга ингибиторов 49
1.2.6.2.1 Подбор оптимальных репортеров для детекции работы фермента in
vitro 50
1.2.6.2.2 Разработка системы детекции протеаз in vivo 53
Заключение 55
Глава 2: Результаты и обсуждения 56
2.1 Исследование субстратной специфичности ЛФ методом фагового дисплея 56
2.1.1 Конструирование и скрининг фаг-дисплейной библиотеки 56
2.1.2 Анализ структуры субстратов после первого этапа скрининга 58
2.1.3 Создание системы детекции активности ЛФ с использованием флуоресцентных белков 60
2.1.4 Оценка эффективности субстратов ЛФ после первого этапа скрининга 63
2.1.5 Создание и скрининг удлиненной библиотеки субстратов 63
2.1.6 Исследование расщепления субстратов ЛФ после скрининга расширенной библиотеки 64
2.1.7 Определение положения сайтов расщепления полученных субстратов 66
2.1.8 Определение влияния точечных мутаций в последовательности субстрата на эффективность взаимодйствия с ЛФ 67
2.2 Исследование механизма фермент-субстратных взаимодействий ЛФ с помощью предстационарной кинетики 69
2.2.1 Взаимодействие ЛФ с субстратами группы ЛФ15 69
2.2.2 Изучение ингибирования ЛФ 73
2.2.3 Протеолитическое расщепление субстрата мутантными формами ЛФ с измененным активным центром 75
2.2.4 Взаимодействие ЛФ с субстратом С20, отобранным из фаговой библиотеки 78
2.2.5 Активация апофермента ЛФ с помощью двухвалентных металлов 80
Заключение 85
Глава 3. Практическая часть 88
Материалы 88
Методы 90
Выводы 99
Список литературы
