Введение
Глава 1 Обзор литературы 15
1.1 Морфологические и культуральные свойства K. pneumonia 15
1.2. Клиническая значимость K. pneumonia 15
1.3 Молекулярно-генетические механизмы множественной лекарственной устойчивости K. pneumoniae 19
1.3.1 Механизмы формирования устойчивости K. pneumoniae к бета-лактамам 20
1.3.2 Устойчивость к аминогликозидам 21
1.3.3 Устойчивость к хинолонам 22
1.3.4 Устойчивость к полимиксинам 22
1.3.5 Устойчивость к тигециклинам 23
1.3.6 Роль мажорных пориновых белков клебсиелл в формировании антибиотикорезистентности 24
1.3.7 Вклад IS элементов в формирование антибиотико-резистентности K. pneumoniae 24
1.3.8 Вклад плазмид K. pneumoniae в формирование антибиотикорезистентности и вирулентности 25
1.4 Факторы вирулентности K. pneumoniae 26
1.4.1 Капсула K. pneumoniae 27
1.4.2 Липополисахарид K. pneumoniae 28
1.4.3 Роль фимбрий 1 и 3 типов в формировании вирулентности K. pneumonia 30
1.4.4 Системы утилизации ионов железа 32
1.4.5 Метаболизм аллантоина 33
1.5 Эволюция K. pneumoniae: классические и гипервирулентные эволюционные ветви 34
1.5.1 Генетические линии K. pneumoniae: сиквенс-типы и клональные комплексы 36
1.5.2 Опасность объединения потенциалов гипервирулентных и классических K. pneumoniae 37
1.6 Заключение по Главе 1 38
Глава 2 Материалы и методы 40
2.1 Микробиологические методы 40
2.1.1 Штаммы микроорганизмов 40
2.1.2 Питательные среды, условия культивирования и хранения бактерий 41
2.1.3 Выделение бактерий из клинического материала 41
2.1.4 Видовая идентификация бактерий 42
2.1.5 Стринг-тест 42
2.1.6 Определение чувствительности к антимикробным препаратам 42
2.1.7 Селекция устойчивого к рифампицину варианта штамма K. pneumoniae KPM9 43
2.2. Биологические методы 43
2.2.1 Лабораторные животные 43
2.2.2 Подготовка бактериальных суспензий для заражения 44
2.2.3 Определение вирулентности штаммов K. pneumoniae для мышей 44
2.2.4 Определение среднелетальной дозы штаммов K. pneumoniae для мышей 44
2.3 Биохимические методы 45
2.3.1 Выделение липополисахаридов K. pneumonia 45
2.3.2 Выделение пориновых белков K. pneumonia 45
2.3.3 Электрофорез в полиакриламидном геле и окрашивание препаратов 46
2.3.4 Электрофорез в агарозном геле 46
2.4 Молекулярно-генетические методы 46
2.4.1 Плазмидные векторы, использованные в работе 46
2.4.2 Конъюгативный перенос плазмид 47
2.4.3 Криотрансформация штаммов бактерий 47
2.4.4 Подготовка ДНК матрицы для полимеразной цепной реакции 48
2.4.5 Выделение ДНК K. pneumoniae для полногеномного секвенирования 48
2.4.6 Выделение плазмидной ДНК бактерий 49
2.4.7 Выделение тотальной РНК 49
2.4.8 Обратная транскрипция 50
2.4.9 Детекция генов антибиотикорезистентности, вирулентности и генов капсулообразования с помощью ПЦР 51
2.4.10 Определение групп несовместимости плазмид 51
2.4.11 Генотипирование штаммов K. pneumoniae методом случайно амплифицируемых полиморфных фрагментов ДНК 51
2.4.12 Мультилокусное секвенирование-типирование штаммов штаммов K. pneumoniae 52
2.4.13 Секвенирование нуклеотидных последовательностей изучаемых генов 52
2.4.14 Полногеномное секвенирование штаммов К pneumoniae 52
2.6. Биоинформационный анализ 53
2.6.1 Дизайн и синтез олигонуклеотидных праймеров 53
2.6.2 Анализ нуклеотидных последовательностей генов бактерий 53
2.6.3 Определение клональных комплексов К pneumoniae 53
2.6.4 Филогенетический анализ генов wabG и uge штаммов К pneumoniae 54
2.6.5 Анализ полных геномов штаммов К pneumoniae 54
2.6.6 Филогенетический анализ полных геномов штаммов К pneumoniae 54
Результаты и обсуждение 55
Глава 3 Фенотипы и генотипы антибиотикорезистент-ности госпитальных штаммов Klebsiella pneumoniae 55
3.1. Оценка эпидемиологической значимости Klebsiella pneumoniae среди грамотрицательных возбудителей госпитальных инфекций 55
3.2 Фенотипическая характеристика коллекции госпитальных штаммов Klebsiella pneumoniae, выделенных в РФ в 2012-2016 гг 56
3.3 Генетические детерминанты антибиотикорезистентности в штаммах К pneumoniae 58
3.4 Генотипы резистентности (R-генотипы) госпитальных штаммов Klebsiella pneumoniae и их распространенность 60
3.5 Вариабельность генов пориновых белков К pneumoniae 61
3.6 Влияние встраивания IS-элементов в ген порина отрКЗб на чувствительность к антибактериальным препаратам у госпитальных штаммов К pneumoniae 63
3.6.1 Характеристика штаммов К pneumoniae с инактивированным геном отрКЗб 63
3.6.2 Клонирование гена отрКЗб и восстановление продукции порина ОтрК36 в штамме К pneumoniae KPB367K/15 67
3.6.3 Влияние продукции белка ОтрК36 на фенотип антибиотикорезистентности штаммов К pneumoniae 69
3.6.4 Экспрессия генов бета-лактамаз в штаммах, отличающихся по наличию продукции поринового белка OmpK36 70
3.7 Оценка роли К pneumoniae как источника распространения генов эпидемических карбапенемаз ШохА-48-нке типа среди штаммов энтеробактерий в госпитальной среде 72
3.7.1 Антибиотикорезистентность изолятов энтеробактерий, выделенные в 2013-2014 гг 72
3.7.2 Гены антибиотикорезистентности изолятов энтеробактерий, выделенных в 2013-2014 г 74
3.7.3 Разнообразие RAPD-генотипов клинических изолятов, выделенных в 2013-2014 гг 76
3.7.4 Распространение генов карбапенемаз blaOXA-48-like в госпитальной среде 77
3.7.5 Плазмидная локализация генов blaOXA-48-like 81
3.8 Клинические штаммы K. pneumoniae, несущие ген эпидемической карбапенемазы blaNDM-1, выделенные в г. Москве в 2016 г 84
3.8.1 Чувствительность к антибактериальным препаратам клинических штаммов K. pneumoniae, несущих ген карбапенемазы blaNDM-1 86
3.8.2 Генетические детерминанты устойчивости к антибактериальным препаратам штаммов K. pneumoniae, несущих ген карбапенемазы blaNDM-1 87
3.9 Изучение носительства грамотрицательных бактерий и генов антибиотикорезистентности у пациентов нейрореанимации г. Москвы в рамках трех одномоментных исследований в 2015 г 88
3.9.1 Генетические детерминанты антибиотикорезистентности бактериальных культур, выделенных в рамках одномоментных исследований 90
3.10 Разработка методических рекомендаций для детекции генов антибиотикорезистентности в штаммах K. pneumoniae 93
3.11 Заключение по Главе 3 95
Глава 4 Фенотипы и генотипы вирулентности штаммов Klebsiella pneumoniae 97
4.1 Клиническая значимость изучаемых штаммов K. pneumoniae 97
4.2 Оценка вирулентности штаммов K. pneumoniae на мышиной модели 98
4.3 Гипермукоидный фенотип клинических штаммов K. pneumoniae 99
4.4 Сиквенс-типы и клональные комплексы K. pneumoniae 101
4.5 Капсула, капсульные серотипы и липополисахариды K. pneumoniae. 105
4.6 Гены и генотипы вирулентности клинических штаммов K. pneumoniae . 108
4.7 Разработка методических рекомендаций для детекции генов вирулентности в штаммах K. pneumoniae 111
4.8 Значимость гена регулятора гипермукоидного фенотипа rmpA для проявления вирулентности K. pneumoniae для мышей.. 112
4.9 Вариабельность генов, участвующих в синтезе липополисахаридов K. pneumoniae 114
4.10 Сочетание признаков мультирезистентности к антибактериальным препаратам и вирулентности у клинических штаммов K. pneumoniae 116
4.11 Оценка вирулентности штамма K. pneumoniae KPM9 после экспериментальной передачи плазмид резистентности 119
4.12 Заключение по Главе 4 123
Глава 5 Анализ полных геномов гипервирулентных и авирулентных для мышей штаммов Klebsiella pneumoniae 125
5.1 Характеристика полных геномов трех высоковирулентных и двух авирулентных для мышей штаммов K. pneumoniae 125
5.2 Сиквенс-типы и капсульные типы 125
5.3 Филогенетический анализ полных геномов изучаемых штаммов 127
5.4 Сравнительный анализ резистомов и факторов вирулентности высоковирулентных и мультирезистентных штаммов K. pneumoniae 129
5.5 Выявление последовательности профага в мультирезистентном штамме K. pneumoniae KPB1470/16 сиквенс-типа ST147 133
5.7 Заключение по Главе 5 135
Заключение 136
Выводы 139
Перечень сокращений, условных обозначений, символов, единиц и терминов 141
Список использованных источников 143
Список работ, опубликованных по теме диссертации 167
Приложение А 172
Приложение Б 175
Приложение В 177
Приложение Г 178
