Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1 Общая характеристика рода Rotavirus 12
1.1.1 Морфология ротавирусного вириона 17
1.1.2 Жизненный цикл и патогенные свойства ротавирусов 20
1.2 Особенности организации ротавирусного генома 35
1.2.1 Структура генома ротавирусов .36
1.2.2 Особенности экспрессии генов ротавирусов .38
1.2.3 Генетическая изменчивость ротавирусов .40
1.2.4 Механизмы изменчивости ротавирусов
1.3 Эпидемиология и вакцинопрофилактика ротавирусных заболеваний 48
1.4 Методы исследований генетического рпазнообразия ротавирусов
1.4.1 Эмпипрические методы.. 59
1.4.2 Аналитические методы 66
1.5 Заключение к обзору литературы 71
Глава 2. Материалы и методы исследования. 74
2.1 Материалы 74
2.1.1 Лабораторная коллекция первично-охарактеризованных, материалов диких ротавирусных штаммов 74
2.1.2 Реактивы 74
2.1.3 Данные из внешних источников.. 75
2.2 Методы .76
2.2.1 Анализ нуклеотидных последовательностей 76
2.2.2 Конструирование специфических праймеров и зондов 77
2.2.3 Пробопоготовка (приготовление копроэкстрактов, выделение вирусных РНК).. 81
2.2.4 Реакция обратной транскрипции (ОТ) 83
2.2.5 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 83
2.2.6 Моноспецифическая ПЦР в режиме реального времени (ПЦР – РВ) 84
2.2.7 Мультиплексная ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентной детекцией (МП – ПЦР – РВ) .86
2.2.8 Подготовка продуктов ПЦР в препаративных количествах 86
2.2.9 Электрофоретический анализ ДНК
2.2.10 Секвенирование элементов генома ротавирусов .89
2.2.11 Исследование эмпирически полученных данных аналитическими методами .89
Глава 3. Результаты исследования
3.1 Оценка эпидемиологической ситуации по ротавирусной инфекции в Московском регионе 93
3.2 Формирование коллекции вируссодержащих материалов .98
3.3 Отработка методической базы и критериев генотипирования ротавирусов на основе вариантов метода ПЦР .100
3.3.1 Выбор критериев, наиболее полно отражающих генетические характеристики штаммов ротавирусов 100
3.3.2 Определение специфических локусов, подбор праймеров и зондов для дифференциального выявления аллелей генов ротавирусов методом ПЦР 101
3.3.3 Конструирование праймеров и ДНК зондов системы генотипирования .107
3.4 Оптимизация методов и условий натурных, генетических исследований ротавирусов вариантами ПЦР и секвенированием 111
3.4.1 Оптимизация выделения ротавирусной РНК 111
3.4.2 Оптимизация условий обратной транскрипции .112
3.4.3 Оптимизация условий мультиплексной ПЦР-РВ (МП–ПЦР–РВ) для
одновременного выявления нескольких вариантов генов ротавирусов .114
3.4.4 Оптимизация получения и анализа нуклеотидных последовательностей геномов диких штаммов ротавирусов 121
3.5 Разработка внутренних, лабораторных контролей и эталонов .125
3.6 Определение генетической структуры ротавирусов группы А Московского региона 2009-2014г.г 133
Глава 4 Обсуждение результатов исследования .140
Заключение .154
Выводы 158
Список сокращений 159
Список литературы
