Введение
1. Обзор литературы 12
1.1 Трансгенные кролики - источники биологически активных рекомбинантных белков и модели болезней человека 12
1.2. Основные способы введения генно-инженерных конструкций в эмбрионы животных 29
1.3. Эффективность интеграции трансгена в геном млекопитающих 49
2. Материалы и методы исследований 55
2.1. Получение кроличьих эмбрионов 55
2.2. Генно-инженерные конструкции использованные в работе 56
2.3. Получение культуральной среды, содержащей ретровирусную конструкции 59
2.4. Микроинъекция генно-инженерных конструкций в зиготы 61
2.5. Культивирование кроличьих эмбрионов in vitro 62
2.6. Трансплантация эмбрионов самкам-реципиентам 63
2.7. Определение интеграции трансгена в геном эмбрионов и рождённого потомства 64
3. Результаты собственных исследований 66
3.1. Изучение факторов, влияющих на эффективность получения потомства кроликов из зигот, микроинъецированных различными генно-инженерными кон струкциями 66
3.1.1 Суперовуляция у крольчих доноров эмбрионов разных пород и разного возраста 67
3.1.2. Приживляемость эмбрионов в организме крольчих-реципиентов в зависимости от числа трансплантированных зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями 68
3.1.3. Влияние породы и возраста крольчих-реципиентов на сукрольность и приживляемость эмбрионов 70
3.2. Влияние микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот культуральной среды, содержащей генно-инженерную конструкцию, встроенную в ретровирусный вектор, на жизнеспосрбность эмбрионов и интеграцию трансгена
в геном первичных трансгенных кроликов 73
3.2.1. Приживляемость эмбрионов, развившихся из зигот, микроинъеци-рованных генно-инженерной конструкцией aSl-Cn-hG-CSF, встроенной в ретровирусный вектор, и интеграция трансгена в геном рожденных кроликов 74
3.2.2. Передача трансгена потомству первичными трансгенными животными, полученными с использованием генно-инженерной конструкции, встроенной в ретровирусный вектор 76
3.3. Изучение возможности получения трансгенных кроликов при введении ретровирусной конструкции в перивителлиновое пространство яйцеклеток, находящихся на стадии метафазы II 78
3.3.1. Приживляемость эмбрионов при трансплантации крольчихам-донорам извлечённых у них зигот (метод донор-реципиент) 79
3.3.2. Изучение возможности получения трансгенных животных при введении генно-инженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, в ещё неоплодотворённые яйцеклетки, извлечённые из яйцеводов крольчих, осеменённых самцом 81
3.4. Влияние микроинъекции в пронуклеусы зигот различных плазмидных генно- инженерных конструкций на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном рождённого потомства 85
3.4.1. Влияние различных плазмидных генно-инженерных конструкций на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена на стадии эмбриона 86
3.4.2. Приживляемость эмбрионов, микроинъецированных плазмидными генно-инженерными конструкциями, в организме самок-реципиентов и частота интеграции трансгена в геном рожденного потомства 89
3.5. Влияние микроинъекции в пронуклеусы кроличьих зигот плазмидной генно- инженерной конструкции совместно с рестриктазой на жизнеспособность и интеграцию трансгена в геном эмбрионов 93
3.5.1. Влияние совместной микроинъекции плазмидной генно-инженерной конструкции с рестриктазой Xbal на жизнеспособность кроличьих эмбрионов и частоту интеграции трансгена, определенную на стадии бла-стоцисты 94
4. Обсуждение полученных результатов 98
5. Выводы 118
6. Практические предложения 120
Список литературы 121
