Введение
Обзор литературы 17
Некоторые проблемы создания лекарственных препаратов на основе пептидов 17
Меланокортины и их аналоги, функции в ЦНС 19
Пептидное семейство меланокортинов 19
Меланокортины как нейропеитиды 21
Локализация меланокортинов в мозге млекопитающих. Проблема места синтеза меланокортинов. Нормальный и поврежденный мозг 22
Общие трофические свойства меланокортинов 25
Влияние меланокортинов на нейроны ЦНС 26
Ноотропные и нейропротекторные эффекты меланокортинов 27
Ноотропные и иейропротекторные эффекты Семакса 31
Нейротрофины и их характеристика 37
Общая характеристика семейства нейротрофинов 37
Характеристика нейротрофина BDNF 41
Экспрессия BDNF в нервной системе 42
Строение гена bdnf и регуляция его транскрипции 44
Рецепторы для BDNF 48
Суточные колебания уровня BPNF 49
Факторы, влияющие на экспрессию BDNF в ЦНС 52
Нейродегенерации Адьцгеймеровского типа и гены нресенилина 62
Клинические и гистопатологические признаки болезни Альцгеймера 63
Генетические факторы и гены Болезни Альцгеймера 66
Функции генов пресенилинов 72
Участие пресенилинов в ап о птозе клеток 73
Материалы и методы исследования 76
Использованные материалы и реагенты 76
Приготовление, хранение и проверка чистоты препаратов Семакса и других пептидов 76
Выделение плазматических мембран мозга 77
Определение концентрации белка 78
Радиолигандный анализ 78
Изучение деградации Семакса в присутствии плазматических мембран и клеточных культур 79
Получение и ведение первичных клеточных культур 81
Оценка выживаемости нейронов in vitro : 89
Оценка уровня пролиферации клеток 90
Подготовка плазмидной ДНК для трансфекции культур клеток млекопитающих 91
Трансфекция клеток линии РС12 с помощью электропорации 91
Получение трансфидированных поликлональных культур клеток РС12 и клонов индивидуального происхождения 93
Выделение высокополимерной геномной ДНК клеточных культур 95
Анализ стабильно-траясфицированных культур РС12 с помощью полимеразной цепной реакции (ППР) 95
Изучение дифференцировки РС12 клеток 96
Анализ пролиферации клеток PC 12 96
Изучение апоптоза в трансфнцированных культурах клеток РС12 97
Получение антител, использованных в работе 97
Выделение белковых гомогенатов из культур клеток PC 12, глиальных и нейрональных культур. Электрофорез белков в нолиакриламидиом геле. Вестерн-блоттинг 98
Анализ количества фосфорилированной формы МАР-киназы о помощью иммуиоблотинга 99
Определение активности холинацетилтрансферазы 99
Оценка уровня экспрессии мРНК нейротрофинов в культуре глии 100
Оценка уровня экспрессии trkB мРНК в первичных культурах глиальных клеток 102
Оценка уровня экспрессии мРНК для bdnf и trkB in vivo 103
Определение уровня BDNF в отделах мозга крысы in vivo 107
Статистнстичеекая оценка результатов 108
Результаты и их обсуждение 109
Связывание Се макс а с плазматическими мембранами базальных ядер переднего мозга крысы 109
Деградация Семакса в присутствии плазматических мембран, культивируемых нейронов и глии базальных ядер переднего мозга крысы. 114
Влияние Семакса на пролиферацию глии базальных ядер переднего мозга крысы in vitro 119
Влияние Семакса на выживаемость культивируемых нейронов, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы 121
Влияние Семакса на выживаемость тирозингидроксилаза-положительных нейронов, полученных из среднего мозга эмбрионов крысы 127
Исследование нейропротекторных эффектов Семакса в клеточных моделях индуцированной нейротоксичности 127
Модель гибели дофаминергических нейронов in vitro, индуцированной 6ГДА 129
«Пресенилиновая» клеточная модель болезни Альцгеймера 130
Влияние а-МСГ на уровень BDNF в первичных нейрональных культурах, полученных из среднего мозга эмбрионов крыс 146
150 162 165
Влияние Семакса на экспрессию мРНК BDNF и NGF в культуре глиальных клеток, полученных из базальных ядер переднего мозга крысы 146
Влияние Семакса на уровень BDNF в базальных ядрах переднего мозга крысы in vivo 148
Влияние Семакса на экспрессию BDNF в гмшокампе. мозжечке и коре больших полушарий мозга крысы in. vivo 150
Влияние Семакса на экспрессию TrkB в гиппокампе крысы 162
Возможный механизм действия Семакса в 1.ЩС 165
Семакс в качестве лекарственного препарата для лечения нейродегенеративных заболеваний (ишемический инсульт, болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона) 172
Клеточная система для тестирования соединений с потенциальной нейр опр о текто риой активностью 176
Заключение 178
