Введение
I. Обзор литературы 8
1.1. Солевой стресс и его влияние на растение 8
1.1.1. Гиперосмотический стресс 8
1.1.2 Окислительный стресс 9
1.2. Солеустойчивость растений 10
1.2.1. Клеточные детерминанты солеустойчивости 11
1.3. Ионный гомеостаз растительной клетки при солевом стрессе 11
1.3.1. Поступление ионов натрия в клетку 12
1.3.2. Удаление ионов натрия из растительных клеток 12
1.3.3. Компартментация ионов натрия в клеточных вакуолях 13
1.3.4. Поступление анионов хлора 13
1.4. Поддержание ионного гомеостаза при солевом стрессе в растениях 13
1.4.1. Начальное поступление в корень и удаление Na+ из клеток корня 13
1.4.2. Контроль поступления Na+ в ксилему 14
1.4.3. Реабсорбция Na+из ксилемы 14
1.4.4. Рециркуляция Na+ по флоэме из листьев обратно в корни 16
1.4.5. Вакуолярная компартментация Na+ в надземной части 16
1.4.6. Плазмалеммарный №+/Н+-антипортер в клетках листьев 17
1.4.7. Накопление Na+ в морфологических образованиях листа 17
1.5. Сигналы трансдукции солевого стресса в растениях 17
1.5.1. SOS сигнальный каскад в Arabidopsis thaliana 17
1.5.2. Сигналы трансдукции гиперосмотического стресса 18
1.5.2.1. АБК и Са2+-зависимые пути передачи стрессовых сигналов 19
1.6. Ка+/Н+-антипортеры эукариот 19
1.6.1. Сравнительный анализ функций Ыа+/Н+-антипортеров эукариот 19
1.6.2. Структурные особенности Ыа+/Н+-антипортеров 20
1.6.3. Структура Ка+/Н+-антипортеров растений 23
1.6.3.1. Плазмалеммарный Ма+/Н+-антипортер 23
1.6.4. Механизм функционирования Ма+/Н+-антипортера 25
1.7. Функционирование На+/Н+-антипортеров в животных клетках 26
1.7.1. Регуляция активности Na+/H+-airranopTepoB житвотных клеток 28
1.8. Ионные транспортеры дрожжей 29
1.9. Функциональное значение Na+/H+- и К+/Н+- антипортеров растений 30
1.9.1. К7Н+-антипортеры 30
1.9.2. На+/Н+-антипортеры 31
1.9.2.1. Биохимические свойства 31
1.9.2.2. Значение Ыа+/Н+-антипортеров для растительной клетки 33
1.9.2.3. Сравнение структуры и функций ионных транспортеров 34
1.10. Регуляция Иа+/Н+-антипортеров растений 35
1.10.1. С-и N-терминальные регуляторные домены 36
1.10.2. Регуляция экспрессии Ыа+/Н+-антипортеров на транскрипционном и посттранскрипционных уровнях 37
1.11. Цели и задачи работы 39
II. Материалы и методы 42
2.1. Объект исследования 42
2.2. Получение растительного материала 42
2.3. Выделение РНК 42
2.4. Синтез первой цепи кДНК 43
2.5. ПЦР 43
2.6. Клонирование 44
2.7. Выделение плазмидной ДНК 44
2.8. Получение и очистка полипептида HvNHX4 для получения поликлональных антител 44
2.9. Электрофорез белков в ПААГ с SDS 49
2.10. Иммуноблоттинг 14-3-3 белков и HvNHX4 49
2.11. Диссоциация сектора Vi от Vo V-АТФазы 49
2.12. Выделение плазматических мембран 50
2.13. Выделение вакуолярных мембран 50
2.14. Фракционирование мембран ячменя центрифугированием в градиенте плотности сахарозы 50
2.15. Измерение АТФ - гидролазной активности в мембранных препаратах 51
2.16. Измерение Н+-транспортной активности Н+-АТРаз 51
2.17. Измерение ионного обмена и пассивной проницаемости везикул для протонов 52
2.18. Реактивы 52
2.19. Статистика 53
III. Результаты 53
3.1. Характеристика выхода, чистоты, ориентации выделенных везикул плазмалеммы и тонопласта 53
3.2. Измерение Н+-транспортной активности ІҐ-АТФаз плазмалеммы и тонопласта... 56
3.3. Измерение пассивной проницаемости везикул для протонов и АТФ-гидролазной активности 59
3.4. Исследование распределения 14-3-3 белков в мембранах тонопласта 61
3.5. Диссоциация Vi сектора V-АТФазыи иммунодетекция белков 14-3-ЗС 61
3.6. Ионный обмен в мембранных везикулах плазмалеммы и тонопласта 62
3.7. Кинетика ионного обмена в везикулах плазмалеммы и тонопласта 65
3.8. Влияние амилорида на ионный обмен 66
3.9. Идентификация предполагаемого К+/Н+- антипортера в ячмене 66
3.10. Установление внутриклеточной локализации HvNHX4 70
3.11. Вестерн анализ HvNHX4 в вакуолярных мембранах, выделенных из разных сортов ячменя 72
3.12. Исследование экспрессии HvNHX4 в разных сортах ячменя 73
IV. Обсуждение 75
4.1. Идентификация предполагаемого вакуолярного К+/Н+-антипортера ячменя HvNHX4 75
4.2. Функционирование ионных транспортеров плазмалеммы и тонопласта в проростках ячменя 79
4.2.1. Н+-АТФазы 79
4.2.2. Ма+/Н+-обменная активность в везикулах плазмалеммы и тонопласта 82
4.2.3. К+/Н+-обменная активность в везикулах тонопласта 87
Заключение 90
Выводы 92
Список литературы 93
