Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы Плазмидные системы биодеградации хлорированных ароматических соединений
1.1. Плазмиды бактерий 11
1.2. Организация и эволюция путей катаболизма хлорароматических соединений 13
1.3. Ключевые гены и ферменты верхних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот 15
1.4. Ключевые гены и ферменты нижних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот 27
1.5. Плазмида pJP4 - модельная плазмида деградации 2,4-Д 30
ГЛАВА 2. материалы и методы исследований
2.1. Объекты исследований 37
2.2. Получение чистых культур штаммов-деструкторов 37
2.3. Идентификация штаммов 38
2.3.1. Классификация штаммов по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам 38
2.3.2. Определение морфологических и морфометрических характеристик клеток методом электронной микроскопии 38
2.3.3. Молекулярно-биологическая идентификация штаммов на основе секвенирования гена 16S рРНК 39
2.3.3.1.Выделение и характеристика суммарной ДНК 39
2.3.3.2. Амплификация, секвенирование и анализ последовательностей генов 16SpPHK 39
2.4. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет 41
2.5. Определение количеств хлорированных феноксиуксусных кислот в культуральной жидкости 42
2.6. Идентификация продуктов метаболизма хлорированных феноксиуксусных кислот 43
2.7. Выделение плазмидной ДНК 44
2.8. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле 44
2.9. Обработка препаратов плазмид рестриктазами и определение размеров фрагментов ДНК 45
2.10. Элиминация плазмид, индуцированная акридиновым оранжевым 45
2.11. Определение устойчивости бактерий к антибиотикам и тяжелым металлам 46
2.12. Трансформация штаммов 47
2.12.1. Приготовление компетентных клеток 47
2.12.2. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК 47
2.13. Конъюгация клеток бактерий 48
2.14. Гибридизация препаратов ДНК на фильтре 49
2.14.1. Получение радиоактивного зонда методом замещения нуклеотидов 49
2.14.2. Иммобилизация плазмидной ДНК на нитроцеллюлозном фильтре 49
2.14.3. Дот-блот гибридизация препаратов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре 50
2.15. Физико-химические свойства и область применения хлорфеноксиуксусных кислот (4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т) 50
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение
3.1.Идентификация штаммов 33-4ch, 36D и 36Т на основе морфолого-морфометрических, физиолого-биохимических признаков и анализа последовательностей генов 16S рРНК 52
3.1.1. Морфолого-морфометрические признаки штаммов 52
3.1.2. Физиолого-биохимические признаки штаммов 58
3.1.3. Анализ последовательностей генов 16S рРНК штаммов 33-4ch, 36D и 36Т 62
3.2. Динамика конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T в периодической культуре 66
3.3. Анализ этапов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T 72
3.4. Анализ плазмидного статуса клеток штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T 76
3.5. Участие плазмид pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T в генетическом контроле деградации хлорфеноксиуксусных кислот 80
3.6. Локализация детерминант резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов на плазмид ах pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T 83
3.7. Горизонтальный перенос плазмид RP33-4ch, pRP36D и pRP36T и экспрессия функций катаболизма и резистентности к антибиотикам и тяжелым металлам в других хозяевах 85
3.8. Дот-блот гибридизация препаратов плазмид pRP33-4ch, pRP36D, рКР36ТирЛ 90
Выводы 92
Список литературы 93
