Введение
1. Введение 7
2.1. Структура генома вгс 8
2.2. Белки вгс 11
2.2.1. Белок капсида 12
2.2.2. Гликопротеины оболочки е1 и е2 14
2.2.3. Белок р7 15
2.2.4. Белки ns2,ns3 и ns4a 15
2.2.5. Белок ns4b 18
2.2.6. Белок ns5a 19
2.2.7. Рнк-зависимая рнк-полимераза (ns5b) 27
2.2.7.1. Структура белка 27
2.2.7.2. Биохимические свойства р-рнкп 31
2.2.7.3. Синтез вирусной phkde novo 35
2.2.7.4. Состав и функционирование репликационного комплекса вгс. Белок-белковые взаимодействия 37
2.2.7.5. Ингибиторы р-рнкп вгс 39
2.3. Жизненный цикл вгс 50
2.3.1. Проникновение вирусных частиц в клетку 51
2.3.2. Репликация вгс 54
2.3.3. Трансляция рнк вгс 54
2.3.4. Протеолитическии процессинг и сборка вирусной частицы 56
2.4. Заключение 58
3. Материалы и методы 59
3.1. Приготовление и трансформация компетентных клеток Е. coli 61
3.2. Трансформация бактериальных клеток 62
3.3. Манипуляции с плазмидной ДНК 62
3.4. Полимеразная цепная реакция 63
3.5. Конструирование плазмид 63
3.6. Экспрессия и выделение NS5B белка 67
3.7. Экспрессия и выделение белка NS5A 69
3.8. Экспрессия и выделение казеинкиназ I и II 69
3.9. Моделирование вторичной структуры мРНК 70
3.10. Выделение РНК и Nothern-blot гибридизация 71
3.11. Препаративное получение (-)-IRES РНК-матрицы для определения активности Р-PHKndenovo 72
3.12. Определение активности РНК-зависимой РНК-полимеразы 72
3.13. Исследование модифицированных ди- и тригидроксибензолов как ингибиторов активности Р-РНКП 74
3.14. Компьютерное прогнозирование сайтов фосфорилирования белка NS5A казеинкиназами I и II 75
3.15. Фосфорилирование белков казеинкиназами I и II 75
3.16. Получение лизата культуры гепатоцитов человека Huh7 76
3.17. Получение и частичная очистка лизата печени кролика 76
3.18. Протеолиз меченого белка NS5A в SDS-ПААГ 77
3.19. Протеолиз меченого NS5A белка в растворе 78
3.20. Анализ продуктов протеолиза NS5А белка 78
3.21. Оценка влияния степени фосфорилирования белка NS5A на активность Р-РНКП 79
3.22. Определение РНК-связывающей активности белкаNS5А 79
3.23, Определение термодинамических параметров взаимодействия белков NS5A и NS5B 80
3. Результаты и обсуждение 82
3.1, Конструирование системы для эффективной экспрессии белков NS5A и NS5B 82
3.2. Изучение физико-химических свойств Р-РНКП ВГС, оптимизация условий определения РНК-полимеразной активности и изучение ингибиторных свойств производных тригидроксибензола (пирогаллола) 94
Фосфорилирование белка NS5A in vitro и оценка влияния степени фосфорилирования белка на его способность ингибированть Р-РНКП ВГС 103
4. Выводы 116
5. Литература 117
Благодарности 145
