Введение
ГЛАВА 1. Введение 6
1.1 Актуальность исследования 6
ГЛАВА 2. Обзор литературы 13
2.2. Геморрагическая лихорадка с почечным синдромом (ГЛПС) и хантавирусный легочный
синдром (ХЛС) 24
2.2.1. Эпидемиология хантавирусов 24
2.2.2. Серологическая прослойка населения проживающего в эндемичных районах 30
2.2.3. Вирус и структура вириона 31
2.2.4. Хантавирусы и их естественные хозяева 35
2.2.5. Инфицирование человека 39
2.2.6. Рекомбинация геномов хантавирусов 40
2.2.7. Клинические проявления хантавирусной инфекции 41
2.2.8. Патогенез ГЛПС и ХЛС 44
2.2.9. Иммунный ответ к хантавирусным антигенам
2.2.10. Генетические маркеры патогенеза хантавирусной инфекции 55
2.2.11. Роль цитокиов в патогенезе хантавирусой инфекции 56
2.2.12. Лечение хантавирусной инфекции и вакцинация 60
ГЛАВА 3. Mатериалы и методы 63
3.1. Клеточные линии и реагенты 63
3.2. Сыворотки крови человека 64
3.3. Вирус 64
3.4. Метод непрямого бляшкообразования 65
3.5. Выделение общей РНК 65
3.6. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ) 65
3.7. Синтез кДНК 67
3.8. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 68
3.9. Анализ ДНК-чипов
3.11. Иммунофлуоресцентный анализ 68
3.12. Иммуногистохимический анализ 70
3.13. Получение клеточной линии, экспрессирующей р78 71
3.14. Твёрдофазный иммуноферментный анализ (ИФА) 71
3.15. Анализ изменения электрофоретической подвижности (EMSA) 72
3.16. Мультиплексный анализ 73
3.17. Микоплазменный тест 74
3.18. Иммуноблотинг 3.20. Mодифицированный анализа белка по Лоури 75
3.21. Получение поликлональных антител к гликопротеину G2. 76
3.22. Получение реассортантных вирусов in vitro 76
3.23. Клональная селекция хантавирусов 77
3.24. Скрининг вирусных реассортантов 77
3.25. Анализ TUNEL 77
3.26. Статистический анализ 78
ГЛАВА 4. Результаты исследований 79
4.1. Получение и исследование реассортантов хантавирусов 79
4.1.1 Выявление реассортации у вирусов ANDV и SNV 79
4.1.2. Иммуногистохимический анализ реассортанта V1 82
4.1.3 Эффективность репликации реассортантов в клетках Vero E6 83
4.2. Исследование патогенеза хантавирусной инфекции in vitro 84
4.2.1 Влияние ФНО- на накопление нуклеокапсидного белка SNV в культуре клеток Vero E6 84
4.2.3 Определение влияния ФНО- на проницаемость монослоя HUVEC 91
4.2.4 Инфицирование альвеолярных макрофагов человека вирусом SNV 92
4.2.5 Синтез ФНО- инфицированными SNV и обработанными ЛПС альвеолярными макрофагами человека 94
4.2.6 Эффект надосадочной жидкости, взятой от инфицированных SNV и обработанных ЛПС альвеолярных макрофагов, на проницаемость монослоя клеток HUEVEC 95
4.2.7 Регуляция экспрессии клеточных генов в эндотелиальных клетках вирусами SNV и PHV 98
4.2.8 Следующие группы генов изменялись под действием хантавирусной инфекции 105
4.2.9 Анализ TaqMan экспрессии отдельных генов
4.2.10 Влияние репликации вирусов на внутриклеточный уровень мРНК гена CCL5 110
4.2.11 Вирус AND стимулирует экспрессию индуцируемого интерфероном белка MxA в клетках эндотелия 112
4.2.12 Эффективность репликации хантавирусов в клетках Vero E6, A549 и HUVEC 112
4.2.13 Влияние хантавирусной инфекции на транскрипцию гена MxA 114
4.2.14 Влияние репликации вирусов на экспрессию гена р78 115
4.2.15 Влияние репликации ANDV на транслокацию IRF-3 в ядро клетки 118
4.2.16 Влияние хантавирусной инфекции на внутриклеточные уровни белка р78 118
4.2.17 Влияние экспрессии р78 на репликацию ANDV в клетках Vero E6 120
4.2.18 Внутриклеточная локализация белка р78 в ANDV инфицированных клетках HUVEC 122
4.2.19 Влияние хантавирусной инфекции на активацию факторов ядерной транскрипции PML, SP100 и ISG-20 в клетках HUVEC in vitro
4.2.21 Колокализация PML с SP100 и его частичная колокализация с DAXX в инфицированных хантавирусом клетках HUVEС 126
4.2.22 PML тесно связан с ISG-20 в инфицированных хантавирусом клетках HUVEC
4.2.24 Активация PML требует экспрессии хантавирусного белка 133
4.2.25 PML и SUMO имеют различную локализацию в инфицированных хантавирусом клетках HUVEC 135
4.2.26 Изучение цитокинового профиля сывороток больных ГЛПС 137
4.3.1. Анализ механизмов низкой эффективности препарата рибавирина при хантавирусной инфекции 142
4.3.1. Неэффективность рибавирина в ингибировании выделения ФНО-, вызванного активацией
RANTES и интерлейкина-6 в инфицированных вирусом АND эндотелиальных клетках
пупочного канатика человека 142
4.3.2 Препарат Рибавирин подавляет транскрипцию гена CCL5 в клетках HUVEC, инфицированных вирусом ANDV 144
4.3.3 Эффект различных концентраций препарата Рибавирин на накопление S-сегмента мРНК вируса ANDV и CCL5 в клетках HUVEC 146
4.3.4 Влияние ФНO- и препарата Рибавирин на активацию NF-B 152
ГЛАВА 5. Обсуждение 155
Заключение 175
Выводы 177
Список сокращений 179
Список литературы 182
