Введение
ГЛАВА 1: Обзор литературы 11
1.1. Патогенез возрастной макулярной дегенерации 11
1.2. Классификация типов клеточной гибели: апоптоз, некроз и аутофагия 16
1.2.1. Молекулярный механизм апоптоза 17
1.2.2 Молекулярный механизм аутофагии 24
1.2.3 Молекулярный механизм программируемого некроза
1.3. Роль апоптоза, аутофагии и некроптоза в патогенезе ВМД 32
1.4. Роль глиальных клеток в патогенезе ВМД
1.4.1. Астроциты 42
1.4.2. Клетки Мюллера 43
1.4.3. Глиоз 45
1.4.4. Микроглия 49
1.4.5. Роль микроглии при дегенерации сетчатки 52
1.5. Крысы OXYS как модель ВМД 57
ГЛАВА 2: Материалы и методы 62
Животные 62
Массовое параллельное секвенирование РНК (RNA-seq) 62
Создание списка генов-регуляторов клеточной гибели, экспрессия изменяется с возрастом в сетчатке крыс OXYS и Вистар 64
Реконструкция и анализ ассоциативных генных сетей генов-регуляторов апоптоза, экспрессия которых в сетчатке крыс OXYS и Вистар различна 64
Забор и хранение образцов 66
Вестерн блот анализ 66
Иммуноферментный анализ 67
Выделение РНК для realime PCR 68
Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ) 69
Очистка образцов РНК методом ДНКазной обработки 69
Реакция обратной транскрипции для получения кДНК 70
Приготовление смеси «стандартной» кДНК 71
Полимеразная цепная реакция в реальном времени (realime PCR) для определения
уровня мРНК исследуемых генов 71
Иммунофлуоресцентный анализ 73
Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия 74
Анализ и обработка изображений з
ГЛАВА 3: РЕЗУЛЬТАТЫ 76
3. 1. Анализ данных секвенирования транскриптома (RNA-seq) для 20-дневных крыс Вистар и OXYS 76
3. 2. Реконструкция генных сетей, ассоцированных с апоптозом в сечатке крыс OXYS на разных стадиях ретинопатии 79
3. 2. 1. Кластерный анализ графов ассоциативных генных сетей 84
3. 3. Сравнение изменений с возрастом процессов клеточной гибели в сетчатке крыс OXYS и Вистар 87
3. 4. Исследование активности гибели клеток сетчатки методом TUNEL 88
3. 5. Анализ вклада аутофагии в развитие ретинопатии у крыс OXYS 89
3. 6. Анализ вклада некроптоза в развитие ретинопатии у крыс OXYS 90
3. 7. Морфофункциональные изменения клеток РПЭ с возрастом и при развитии ретинопатии 92
3. 7. 1. Анализ соотношения моноядерных, двуядерных и полиплоидных клеток в сетчатке крыс Вистар и OXYS в возрасте 20 дней, 3 и 18 мес. 95
3. 8. Исследование изменения микроглии в сетчатке при старении и развитии ретинопатии 96
3. 8. 1. Анализ изменений активированных макрофагов в сетчатке крыс Вистар и OXYS 98
3. 8. 2. Анализ распределения активированных клеток микроглии в сетчатке крысВистар и OXYS 101
3. 9. Исcледование изменения макроглии в сетчатке крыс Вистар и OXYS 103
3. 10. Изменение уровня мРНК nNOS, iNOS и eNOS в сетчатке крыс OXYS при манифестации и прогрессии ретинопатии 105
3. 11. Содержание белка iNOS в сетчатке в возрасте 3 и 18 месяцев крыс OXYS и Вистар 107
ГЛАВА 4: Обсуждение результатов 108
4.1. Сравнительный анализ транскриптома сетчатки 20-дневных крыс OXYS и Вистар 108
4.2. Изменения экспрессии генов, ассоциированных с клеточной гибелью с возрастом и при развитии ретинопатии 109
4.3. Изменения механизмов клеточной гибели в сетчатке крыс OXYS и Вистар с возрастом 115
4.4. Роль дисфункции клеток РПЭ и глии в развитии ретинопатии у крыс OXYS
Заключение 128
Выводы 130
Список литературы 132
