Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 14
1.1. Структура эндоглина 14
1.2. Тканевая и клеточная экспрессия эндоглина 17
1.3. Взаимодействие эндоглина с растворимыми факторами и их рецепторами 20
1.4. Участие эндоглина в клеточном сигналинге 23
1.5. Экспериментальные исследования роли эндоглина в биологии клеток
1.5.1. Роль эндоглина в регуляции пролиферации клеток 29
1.5.2. Роль эндоглина в регуляции миграции и инвазии клеток 31
1.5.3. Эффекты экспрессии эндоглина на адгезионные свойства клеток и организацию их цитоскелета 35
1.5.4. Иммунологические функции эндоглина 37
1.5.5. Регуляция процессов аутофагии в клетках эндотелия посредством эндоглина 38
1.5.6. Регуляция продукции растворимой формы эндоглина
1.6. Роль эндоглина в эмбриональном развитии 39
1.7. Роль эндоглина в патогенезе заболеваний человека
1.7.1. Онкологические заболевания солидной природы 40
1.7.2. Онкогематологические заболевания 41
1.7.3. Наследственная геморрагическая телангиэктазия I типа (HHT1) 42
1.7.4. Патологии беременности 43
1.7.5. Атеросклероз 44
1.8. МКАТ к эндоглину человека и области их применения 46
1.8.1. МКАТ к эндоглину, охарактеризованные в научной литературе 46
1.8.2. Применение МКАТ к эндоглину в иммуногистохимических исследованиях 49
1.8.3. Использование МКАТ к эндоглину в методах неинвазивной диагностики онкологических заболеваний 52
1.8.4. МКАТ к эндоглину как средство направленной доставки токсинов в опухоль 53
1.8.5. МКАТ к эндоглину как средство для анти-ангиогенной терапии онкологических заболеваний 54
1.8.6. Выявление растворимой формы эндоглина в биологических жидкостях 59
ГЛАВА 2. Материалы и методы 63
2.1. Получение рекомбинантных молекул эндоглина 63
2.1.1. Методы очистки и визуализации нуклеиновых кислот 63
2.1.2. Клонирование фрагментов кДНК эндоглина в векторные конструкции 63
2.1.3. Методы культивирования и электротрансформации клеток E.coli 66
2.1.4.Экспрессия и очистка рекомбинантных молекул эндоглина, синтезированных в клетках E.coli 67
2.2. Протоколы иммунизации мышей рекомбинантными молекулами эндоглина 68
2.3. Создание гибридом и получение МКАТ к эндоглину
2.3.1. Гибридизация спленоцитов мыши с миеломными клетками 68
2.3.2. Селекция гибридом-продуцентов антител 69
2.3.3. Наработка и очистка МКАТ 69
2.4. Иммунохимические методы, использованные для выявления молекул эндоглина и специфичных к ним антител 70
2.4.1. Получение рекомбинантных молекул эндоглина, меченных биотином 70
2.4.2. Перйодатный метод конъюгирования МКАТ с пероксидазой хрена
2.4.4. Иммуноферментный анализ 71
2.4.5. Электрофорез и вестерн-блот белков 73
2.4.6. Иммунопреципитация молекул эндоглина из плазмы крови человека 74
2.4.7. Выявление эндоглина на гистологических срезах 75
2.4.8. Определение локализации эндоглина на клетках методом иммунофлуоресценции 75
2.4.9. Выявление экспрессии эндоглина на клетках с помощью метода проточной цитофлуориметрии
2.5. Культуры клеток млекопитающих, использованные в работе 76
2.6. Методы оценки жизнеспособности клеток 77
2.7. Референтные реагенты и наборы 78
2.8. Методы статистической обработки и визуализации данных 78
ГЛАВА 3. Результаты 80
3.1. Получение, характеристика и исследование иммуногенности рекомбинантных молекул эндоглина 80
3.1.1. Анализ аминокислотных последовательностей эндоглина человека и мыши 80
3.1.2. Исследование экспрессии эндоглина различными культурами клеток человека 81
3.1.3. Получение и характеристика рекомбинантных молекул эндоглина 82
3.1.4. Определение иммунохимических методов выявления антител к эндоглину 86
3.1.5. Исследование иммуногенности рекомбинантных молекул эндоглина для мышей F1(SJL/JBALB/c)
3.2. Создание гибридом-продуцентов МКАТ к эндоглину человека 88
3.3. Исследование иммунохимических свойств полученных МКАТ к эндоглину и определение областей их применения
3.3.1. Иммунохимическая характеристика МКАТ 89
3.3.2. Использование МКАТ к линейным эпитопам для выявления эндоглина методами вестерн-блота и иммуногистохимии 93
3.3.3. Использование МКАТ к конформационным эпитопам для выявления экспрессии эндоглина на живых и фиксированных клетках 95
3.4. Создание двухцентровой системы ИФА для количественного определения растворимой формы эндоглина 99
3.4.1. Подбор комплиментарных пар МКАТ и исследование их свойств 99
3.4.2. Характеристика двухцентровой системы ИФА 4Е4-4С9 106
3.5. Возможности применения созданных МКАТ к эндоглину в качестве инструментов для изучения биологии клеток 109
3.5.1. Исследование изменений в экспрессии эндоглина клетками эндотелия и МСК при культивировании в различных режимах 111
3.5.2. Исследование динамики обновления молекул эндоглина на мембране клеток 112
3.5.3. Исследование образования молекул растворимого эндоглина в культурах клеток 113
ГЛАВА 4. Обсуждение 118
Выводы 127
Список литературы
