Введение
Глава 1 Литературный обзор. Молекулярные механизмы регуляции азотного метаболизма в клетках бактерий 19
1.1 Введение 19
1.2 Ассимиляция азота и регуляция азотного метаболизма в клетках бактерий 20
1.2.1 Транспорт глутамина в клетку 20
1.2.2 Транспорт аммония в клетку 22
1.2.3 Поглощение нитратного и нитритного азота 23
1.2.4 АВС-транспортер AmtB 24
1.2.5 Белки AmtB и GlnK в клетках B. subtilis 29
1.3 Биохимические пути ассимиляции источников азота 30
1.3.1 Синтез глутаминовой кислоты 31
1.4 Молекулярные механизмы регуляции экспрессии генов азотного метаболизма 38
1.4.1 Регуляция азотного метаболизма в клетках E. coli 39
1.4.2 Регуляция азотного метаболизма в клетках B. subtilis 45
1.5 Семейство PII белков 54
1.5.1 Сенсорные свойства PII белков на примере GlnB Synechococcus elongatus 59
1.5.2 PII белок B. subtilis 63
1.5.3 PII белки Arabidopsis thaliana 64
1.5.4 PII белки Azospirillum brasilense 65
1.6 Регуляция метаболизма путем внутриклеточного протеолиза регуляторных белков 72
1.6.1 Направленный протеолиз в регуляции клеточного метаболизма 72
1.7 Образование биопленок у бактерий 73
1.7.2 Образование биопленок у B. subtilis 78
Глава 2 Материалы и методы исследования 81
2.1 Методы работы с бактериальными клетками 81
2.1.1 Штаммы 81
2.1.2 Плазмидные векторы 82
2.1.3 Среды и условия культивирования 83
2.1.4 Определение минимальной подавляющей концентрации 85
2.1.5 Определение цитотоксичности 85
2.1.6 Получение мембранной фракции клеток 85
2.1.7 Трансформация клеток E. coli методом теплового шока 86
2.1.8 Трансформация клеток E. coli методом электропорации 86
2.1.9 Трансформация клеток B. subtilis [Anagnostopolous et al., 1961] 86
2.2 Методы работы с рекомбинантной ДНК 87
2.2.1 Выделение геномной ДНК бацилл и лактобацилл методом фенол-хлороформной экстракции 87
2.2.2 Выделение плазмидной ДНК в препаративных количествах методом щелочного лизиса 87
2.2.3 Выделение плазмидной ДНК с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit 88
2.2.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 88
2.2.5 Очистка амплифицированных фрагментов ДНК после ПЦР 91
2.2.6 Рестрикция ДНК 92
2.2.7 Дефосфорилирование ДНК 92
2.2.8 Лигирование ДНК 92
2.2.9 Получение ДНК-дуплексов путем гибридизации 93
2.2.10 Метод энзиматической сборки фрагментов ДНК по Гибсону 93
2.2.11 Электрофорез ДНК 93
2.2.12 Очистка ДНК из агарозного геля 94
2.2.13 Введение точечных мутаций в гены 94
2.3 Схемы получения рекомбинантных конструкций 95
2.3.1 Нокаутирование генов 95
2.3.2 Нокаутирование гена htrA в клетках B. subtilis 96
2.3.4 Получение рекомбинантного штамма B. subtilis с точечной мутацией G93A в белке GlnK 97
2.3.5 Клонирование мутантных генов tnrA B. subtilis 99
2.3.6 Конструирование плазмиды pGP-pTnrA 99
2.3.7 Клонирование мутантных генов glnR B. subtilis 100
2.3.8 Клонирование мутантных генов glnR и potA L. brevis 101
2.4 Методы работы с белками 101
2.4.1 Скрининг рекомбинантных штаммов, обладающих максимальной гиперпродукцией белков 101
2.4.2 Гиперпродукция белков в клетках E. coli и получение клеточных экстрактов 102
2.4.3 Очистка белков на Ni-NTA сефарозе 102
2.4.4 Очистка белков на стреп-тактин сефарозе 102
2.4.5 Преципитация белков сульфатом аммония 103
2.4.6 Гидрофобная хроматография 103
2.4.7 Ионообменная хроматография 103
2.4.8 Гель-фильтрация 104
2.4.9 Диализ белков 104
2.4.10 Определение концентрации белка 104
2.4.11 Электрофорез белков в денатурирующих условиях 104
2.4.12 Окрашивание белковых гелей кумасси синим 105
2.4.13 Окрашивание белковых гелей нитратом серебра 105
2.4.14 Осаждение белков с помощью трихлоруксусной кислоты 105
2.4.15 Иммуноблоттинг (Western Blot) 105
2.4.16 Dot Blot 106
2.4.17 Иммунодетекция 106
2.4.18 Анализ олигомеризации белков методом поперечных сшивок in vitro 107
2.5 Методы анализа взаимодействия макромолекул 107
2.5.1 Анализ взаимодействия белков методом ко-элюции (Pull Down) 107
2.5.2 Иммунопреципитация 108
2.5.3 Иммунопреципитация с антителами, ковалентно сшитыми с белок-А сефарозой 108
2.5.4 Анализ взаимодействия белков со стреп-тагом in vivo (SPINE) 109
2.5.5 Pull Down анализ взаимодействия фактора TnrA с ДНК 109
2.5.6 Метод задержки в геле 110
2.5.7 Исследование взаимодействия белков методом плазмонного поверхностного резонанса (ППР) 110
2.5.8 Исследование взаимодействия белков с ДНК методом плазмонного поверхностного резонанса (ППР) 111
2.6 Аналитические методы 111
2.6.1 Определение активности [З-галактозидазы 111
2.6.2 Определение активности глутаминсинтетазы 112
2.6.3 Окрашивание биопленок кристаллическим фиолетовым 113
2.6.4 Определение содержания ионов аммония 113
2.6.5 Изотермальная титрующая калориметрия 114
2.7 Математические методы 114
2.7.1 Био информатика 114
2.7.2 Статистика 115
Глава 3 Молекулярные механизмы регуляции активности фактора транскрипции ТпгА в клетках Б. subtilis 116
3.1 Анализ структуры фактора транскрипции ТпгА 116
3.1.1 Получение белков ТпгА с усеченной С-концевой последовательностью 116
3.1.2 Определение участков взаимодействия фактора ТпгА с GlnK и глутаминсинтетазой 120
3.1.3 Функциональная роль С-концевого домена фактора ТпгА в образовании димеров и взаимодействии белка с ДНК 121
3.2 Активность и внутриклеточная локализация фактора ТпгА в условиях различных доступности восстановленного азота 128
3.2.1 Влияние белков AmtB, GlnK и глутаминсинтетазы на активность фактора транскрипции ТпгА в клетках бацилл 128
3.2.2 Внутриклеточная локализация фактора ТпгА в различных условиях доступности восстановленного азота 134
3.3 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с глутаминсинтетазой 137
3.3.1 Характеристика взаимодействия глутаминсинтетазы с лигандами 137
3.3.2 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с глутаминсинтетазой 143
3.4 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с РП-подобным белком GlnK 146
3.4.1 Характеристика связывания лигандов белком GlnK методом изотермальной титрующей калориметрии 146
3.4.2 Влияние эффекторных молекул на взаимодействие ТпгА с белком GlnK 148
3.5 Конкурентное взаимодействие GlnK и глутаминсинтетазы с ТпгА как механизм регуляции ДНК-связывающей активности фактора транскрипции 150
3.5.1 Оценка конкурентного взаимодействия GlnK и глутаминсинтетазы c фактором TnrA 150
3.5.2 Белок GlnK и глутаминсинтетаза конкурентно связывают фактор транскрипции TnrA в зависимости от концентраций эффекторных молекул и определяют его ДНК-связывающую активность 152
Глава 4 Фактор транскрипции TnrA подавляет активность глутаминсинтетазы в клетках B. subtilis 157
4.1 Влияние факторов транскрипции TnrA и GlnR на активность глутаминсинтетазы в условиях in vitro 157
4.2 Физиологическое значение подавления in vivo активности глутаминсинтетазы путем связывания с фактором TnrA 161
Глава 5 Протеолитическое расщепление фактора TnrA как альтернативный путь контроля его активности 163
5.1 Фактор TnrA подвергается протеолизу в ответ на полное удаление источника азота 163
5.2 Исследование взаимодействия фактора транскрипции TnrA с белками-партнерами в условиях удаления источника азота 166
5.3 Протеолиз белков TnrA с делециями С-конца белка 173
5.4 Идентификация протеиназы осуществляющей протеолиз фактора транскрипции TnrA в клетках B. subtilis 174
5.4.1 Сбор и анализ экспериментальных данных распознавания полипептидных мишеней белками-регуляторами ClpC и ClpX 174
5.4.2 Идентификация сайта распознавания белков субстратов АТФазами ClpC и ClpX 175
5.4.3 Получение штамма B. subtilis, дефектного по внутриклеточной протеиназе HtrA 178
5.4.4 Протеолиз фактора транскрипции TnrA в клетках B. subtilis , мутантных по внутриклеточным протеазам HtrA, LonA, ClpP 178
5.4.5 Очистка протеолитической активности, осуществляющей протеолиз фактора TnrA 179
Глава 6 Функциональная роль белка GlnK в клетках B. subtilis 184
6.1 Оценка участия консервативных аминокислот в связывани лигандов белком GlnK 184
6.2 Взаимодействие белков GlnK и GlnK93 с фактором TnrA in vitro и in vivo 189
6.3 Влияние точечной мутации G93A в АТФ-связывающем сайте белка GlnK на его локализацию в клетке 192
6.4 Влияние точечной мутации G93A в АТФ-связывающем сайте на регуляторные функции белка GlnK 193
6.5 Регуляторный белок GlnK необходим для ассимиляции глутамина клетками B. subtilis 196
Глава 7 Система регуляции азотного обмена бацилл как мишень антибактериальных препаратов 199
7.1 Скрининг производных 2(5Н)-фуранона, подавляющих образование биопленки клетками B. subtilis 199
7.2 Определение клеточных мишеней для фуранонов 202
7.2.1 Влияние фуранонов на систему регуляции чувства кворума бацилл (ComP-ComA) 202
7.2.2 Влияние фуранонов на систему регуляции азотного метаболизма 203
7.2.3 Влияние фуранонов на систему регуляции образования биопленки 205
7.3 Оценка влияния фуранонов на эффективность антибиотиков в отношении клеток в составе биопленки 206
Глава 8 Биохимическая характеристика PII подобного белка PotN в клетках Lactobacillus brevis subsp gravesensis 209
8.1 Характеристика генного окружения гена potN и анализ аминокислотной последовательности белка PotN 209
8.2 Очистка белка PotN и оценка олигомеризации 212
8.3 Оценка взаимодействия белка PotN с различными лигандами 215
8.4 Рентгеноструктурный анализ белка PotN 218
8.5 Идентификация белков-партнеров для взаимодействия с белком PotN в клетках L. brevis 220
8.6 Характеристика взаимодействия белка PotN с белками-партнерами в бактериальной двугибридной системе и in vitro 226
8.7 Характеристика влияния белка PotN на ДНК-связывающую активность фактора транскрипции GlnR in vitro 230
Глава 9 Обсуждение результатов 233
Заключение 253
Благодарности 256
Список использованных источников 257
Приложение 1 283
Приложение 2 299
