Введение
3. Обзор литературы 11
3.1. Строение и функции протеасомы 11
3.1.1. 20S протеасома 12
3.1.2. 26S протеасома 15
3.1.3. Альтернативные регуляторы 18
3.2. Механизмы гидролиза субстратов протеасомой 20
3.2.1. Убиквитин-зависимый протеолиз 20
3.2.1.1. Система убиквитинирования 20
3.2.1.2. Убиквитиновые цепи 23
3.2.1.3. Система деубиквитинирования 26
3.2.1.4. Рецепторы убиквитина 27
3.2.1.4.1. Протеасомные рецепторы убиквитина 27
3.2.1.4.2. Непротеасомальные рецепторы убиквитина 28
3.2.1.4.3. p97/VCP/Cdc48p 30
3.2.1.5. Инициация деградации 32
3.2.1.6. Процессинг 34
3.2.2. Убиквитин-независимый протеолиз 35
3.3. Основный белок миелина (MBP) 40
3.3.1. Роль основного белка миелина и протеасомы в развитии рассеянного склероза 42
4. Материалы и методы 44
4.1. Работа с нуклеиновыми кислотами 46
4.1.1. Амплификация фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции 46
4.1.2. Рестрикция 47
4.1.3. Лигирование 47
4.1.4. Выделение плазмидной ДНК 47
4.1.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле 47
4.1.6. Электрофорез ДНК в полиакриламидном геле 47
4.1.7. Электроэлюция 48
4.1.8. Секвенирование плазмидной ДНК 48
4.1.9. Секвенирование на платформе Illumina MiSeq 48
4.1.10. Создание генетических конструкций 48
4.1.11. Анализ экспресии генов с помощью ПЦР в реальном времени. 49
4.2. Работа с белками 49
4.2.1. Денатурирующий электрофорез в полиакриламидном геле 49
4.2.2. Иммуноблоттинг 50
4.2.3. Иммунопреципитация 50
4.2.4. Фракционирование протеасомы ультрацентрифугированием 50
4.2.5. Анализ активности протеасомы in vitro 51
4.2.6. Выделение, ацетилирование и деиминирование MBP 51
4.2.7. Протеолиз белков in vitro 51
4.2.8. In vitro трансляция 52
4.2.9. Получение и фракционирование лизата ретикулоцитов 52
4.2.10. Конъюгация MBP in vitro. 52
4.3. Хроматографические процедуры 52
4.3.1. Выделение протеасомы. 52
4.3.2. Выделение и очистка рекомбинантных белков 53
4.3.3. Обращенно-фазовая хроматография 54
4.3.4. Метод поверхностного плазмонного резонанса 54
4.4. Методы работы с бактериями Escherichia coli 55
4.4.1. Получение электрокомпетентных клеток 55
4.4.2. Получение химически компетентных клеток 55
4.4.3. Трансформация клеток E. coli методом электропорации 55
4.4.4. Трансформация клеток E. coli методом теплового шока 56
4.4.5. ПЦР c колоний 56
4.4.6. Ночная культура 56
4.5. Методы работы с эукариотическими клетками линии. 57
4.5.1. Поддержание в культуре эукариотических клеток линии HEK. 57
4.5.2. Приготовление музея эукариотических клеток 57
4.5.3. Выведение линии эукариотических клеток из заморозки 57
4.5.4. Трансфекция эукариотических клеток методом липофекции 57
4.5.5. Получение культуры астроцитов 58
4.5.6. Сортировка клеток с помощью проточной цитометрии 58
4.6. Работа с мышами 59
4.6.1. Определение максимальной толерантной дозы 1i-специфического пептидилальдегида IPSI-001 59
5. Результаты и обсуждение 60
5.1. Исследование взаимосвязи структуры полиубиквитиновой цепи и эффективности деградации протеасомных субстратов 60
5.1.1. Подбор оптимальных условий для внутриклеточного энзиматического мечения белков резоруфином 61
5.1.2. Изучение внутриклеточного гидролиза белков протеасомой в физиологических условиях с использованием методики PRIME 63
5.1.3. Анализ внутриклеточной деградации белков с применением комбинации методов PRIME и проточной цитометрии 65
5.1.4. Определение времени полужизни молекулы убиквитина в клетках млекопитающих 68
5.1.5. Определение средней длины полиубиквитиновой цепи в состоянии динамического равновесия 71
5.1.6. Анализ стабильности полиубиквитиновых цепей различного типа ветвления 74
5.1.7. Изучение особенностей моноубиквитинирования гистона Н2А 76
5.2. Изучение молекулярного механизма убиквитин-независимого гидролиза основного белка миелина протеасомой 79
5.2.1. Исследование необходимости убиквитинирования MBP в процессе его гидролиза протеасомой 79
5.2.2. Роль заряда в убиквитин-независимом гидролизе MBP протеасомой 83
5.2.3. Локализация протеасомного дегрона в составе последовательности MBP 84
5.2.4. Создание искусственных убиквитин-независимых дегронов на основе последовательности MBP 89
5.2.5. Поиск субъединицы в составе регуляторных элементов протеасомы, осуществляющей функцию рецептора оснОвных субстратов 96
5.2.6. Анализ изменения состава регуляторных комплексов протеасомы в условиях протекания нейродегенеративных процессов 102
5.3. Подходы к избирательному контролю процессинга основного белка миелина протеасомой 105
5.3.1. Апробация 1i-специфического пептидилальдегида IPSI-001 в качестве ингибитора иммунопротеасомы 105
5.3.2. Влияние деиминирования МВР пептидиларгининдеиминазой (PAD) на его гидролиз протеасомой . 107
6. Заключение 110
7. Выводы 112
8. Список литературы 113
