Введение…………………………………………………………………… 9
Актуальность и разработанность темы исследования……………… 9
Цель исследования…………………………………………………… 11
Задачи…………………………………………………………………. 11
Научная новизна……………………………………………………… 12
Теоретическая и практическая значимость работы………………… 15
Методология и методы исследования………………………………. 16
Положения, выносимые на защиту…………………………………. 17
Степень достоверности и апробация результатов…………………. 18
Личный вклад автора в проведение исследования………………… 18
Апробация работы…………………………………………………… 19
Публикации…………………………………………………………… 21
Соответствие диссертации паспорту научной специальности……. 22
Структура и объем работы…………………………………………… 22
Благодарности………………………………………………………… 22
Конкурсная поддержка работы……………………………………… 23
Глава 1. Половое и бесполое размножение посредством семян……….. 24
1.1 Особенности полового размножения растений…………………. 26
1.2 Эволюция и развитие женского гаметофита (зародышевого
мешка) ………………………………………………………………. 28
1.3 Структурное разнообразие женских гаметофитов
покрытосеменных…………………………………………………... 32
1.4 Гаметофитный апомиксис и его значение для сельского
хозяйства……………………………………………………………. 36
3
Глава 2. Молекулярно-генетическая регуляция развития женского
гаметофита………………………………………………………………… 43
2.1 Развитие женского гаметофита покрытосемянных……………… 43
2.1.1 Мегаспорогенез…………………………………………………… 44
2.1.2 Мегегаметогенез…………………………………………………. 46
2.1.3 Двойное оплодотворение……………………………………. 46
2.1.4 Начало эндоспермогенеза и эмбриогенеза…………………. 47
2.2 Развитие пыльника и мужского гаметофита……………………… 48
2.3 Идентификация генов, влияющих на развитие гаметофита……... 50
2.3.1 Инсерционный мутагенез для получения мутантных линий,
влияющих на репродукцию растений……………………………… 53
2.3.2 Двухступенчатый скрининг, направленный на изоляцию
гаметофитных и эмбриолетальных мутантов……………………... 56
2.3.3 Анализ эффективности генетической передачи
(трансмиссионный анализ) …………………………………………. 68
2.3.4 Определение количества Ds-элементов в геноме каждой
мутантной линии ……………………………………………………. 71
2.3.5 Идентификация фланкирующих встроенный Ds-элемент
последовательностей и анализ инсерционных линий из других
коллекций…………………………………………………………….. 72
2.3.6 Анализ фенотипа пыльцы (мужских гаметофитов) у
исследуемых мутантов……………………………………………… 79
2.3.7 Гаметофитные мутации демонстрируют плейотропные
эффекты при остановке развития гаметофита…………………….. 81
2.3.8 Гаметофитные мутации часто связаны с хромосомными
перестройками………………………………………………………. 83
Глава 3. Молекулярно-генетическая регуляция эмбриогенеза растений. 85
4
Глава 4. Влияние и регуляторная функция убиквитиного метаболизма
на развитие женского гаметофита и эмбриогенез растений……………. 92
4.1 Убиквитин-протеасомный метаболический путь и его связь
с эмбриогенезом………………………………………………………... 92
4.1.1 Субъединица RPN1 протеасомы 26S играет важную роль
в эмбриогенезе у арабидопсиса. Геном Arabidopsis thaliana
содержит два гена RPN1……………………………………………. 95
4.1.2 Характеристика мутантов с инсерциями транспозонов в
генах RPN1a и RPN1b……………………………………………. 97
4.1.3 Нарушение гена RPN1a вызывает зиготическую
эмбриолетальность………………………………………………… 99
4.1.4 Зародыши, гомозиготные по мутациям в RPN1a
останавливают свое развитие на глобулярной стадии…………… 103
4.1.5 У мутантных зародышей rpn1a наблюдались дефекты
прогрессии клеточного цикла……………………………………… 106
4.1.6 Гены RPN1 экспрессируются как в вегетативных, так и
репродуктивных органах…………………………………………… 107
4.1.7 Гены RPN1a и RPN1b не имеют дублирующих функций…. 113
4.1.8 Две изоформы RPN1 функционально эквивалентны………. 116
4.2 Выводы……………………………………………………………… 118
4.2.1 Для нормального эмбриогенеза необходим RPN1a, но не
RPN1b………………………………………………………………… 120
4.2.2 Нарушение убиквитинирования белка, но не функции
RPN1, вызывает аномалии гаметогенеза…………………………... 123
4.2.3 RPN1a и RPN1b функционально эквивалентны, но во
время репродуктивного развития их действие не является
избыточным…………………………………………………………. 124
4.3 Значение и функция куллинов для убиквитин - 26S-протеасомного
пути. Гены CUL3A и CUL3B арабидопсиса необходимы для
нормального эмбриогенеза……………………………………………… 126
5
4.3.1 У мутанта с потерей функции cul3b не наблюдается
морфологических дефектов………………………………………… 128
4.3.2 В репродуктивных органах и во время эмбриогенеза CUL3a
и CUL3b экспрессируются перекрывающимися паттернами……. 132
4.3.3 Нарушение генов CUL3a и CUL3b снижает гаметофитную
передачу и вызывает материнский эффект гибели зародышей....... 135
4.3.4 Потеря функции CUL3 влияет на формирование паттерна
зародыша арабидопсиса и на развитие эндосперма………………. 140
4.3.5 Двойные мутанты cul3a-1 cul3b-1 завершают эмбриогенез,
но вскоре после прорастания проростки останавливают свой
рост…………………………………………………………………... 142
4.4 Выводы……………………………………………………………… 143
4.4.1 Мутанты арабидопсиса cul3a-1 cul3b-1 останавливают свое
развитие на нескольких стадиях эмбриогенеза…………………… 143
4.4.2 Играет ли CUL3 роль в контроле клеточного цикла?............. 145
4.4.3 Все ли растительные E3 лигазы на основе CUL регулируют
биосинтез фитогормонов и/или передачу сигналов?....................... 146
4.5 Роль Е3 лигаз, содержащих CUL4 (CRL4s). Комплекс CUL4-DDB1
арабидопсиса взаимодействует с MSI1 и является необходимым
для поддержания родительского импринтинга гена MEDEA………… 147
4.5.1 MSI-подобные белки представляют собой эволюционно
консервативные белки WD40, которые содержат мотивы WDxR 150
4.5.2 MSI1 у арабидопсиса ассоциируется с DDB1A и CUL4……. 152
4.5.3 CUL4 и его адаптеры DDB1A и DDB1B необходимы для
нормального протекания эмбриогенеза…...………………….…… 155
4.5.4 CUL4 экспрессируется во время эмбриогенеза………........... 164
4.6 Значение комплексов на основе CUL4 для поддержания
родительского импринтинга гена MEDEA……………………………. 166
4.6.1 У мутантов cul4 теряется импринтированние экспрессии
MEA…………………………………………………………………… 166
6
4.6.2 При дефиците CUL4 в семенах накапливаются транскрипт
и белок MEA………………………………………………………… 174
4.7 Выводы……………………………………………………………… 175
Глава 5. Нарушение функции экзосом способствует возникновению
гаметофитного и эмбриолетального фенотипов и аномалий развития
растений………………………………………………….............................. 180
5.1 Состав внутреннего контура экзосомы арабидопсиса…………... 182
5.2 Мутации в коровых субъединицах экзосом арабидопсиса
вызывают уникальные фенотипы……………………………………... 185
5.3 Глобальный анализ мишеней экзосом арабидопсиса высокого
разрешения……………………………………………………………… 193
5.4 РНК-мишени экзосомы арабидопсиса……………………………. 201
5.4.1 Стабильные структурные РНК………………………... 201
5.4.2 РНК, ассоциированные с гетерохроматическими
повторами, и новые некодирующие РНК…………………... 203
5.5 Выводы…………………………………………………………... 205
Глава 6. Молекулярно-генетическая регуляция апомиксиса и
использование геномных технологий для его исследования…………... 207
6.1 Гены, потенциально ассоциированные с апомиксисом……… 209
6.2 Растения из рода Boechera как ресурс для исследования
апомиксиса……………………………………………………...…… 213
6.2.1 Таксономия и местообитания наиболее важных
видов Boechera…………………………………………...…. 214
6.2.2 Преимущества рода Boechera для изучения
апомиксиса…………………………………………………… 218
6.2.3 Цитоэмбриологические и проточно цитометрические
исследования Boechera……………………………………… 219
6.2.4 Популяционно-генетические исследования рода
7
Boechera в отношении апомиксиса……………….................. 229
6.2.5 Наследование и генетические аспекты апомиксиса у
представителей рода Boechera……………………….……... 234
6.3 Анализ экспрессии ассоциированных с апомиксисом генов
CENH3 и APOLLO у половых и апомиктических видов Boechera.. 242
6.3.1 Характеристики гена CENH3 и изоформ его белка…. 244
6.3.2 Характеристика промотора гена CENH3……………… 247
6.3.3 Экспрессия CENH3 во время и после (апо) мейоза
в гинецеях, стручках и пыльниках…………………………. 249
6.3.4 Экспрессия APOLLO во время и после (апо)мейоза в
гинецеях, стручках и пыльниках……………………………. 251
6.3.5 Анализ сходства APOLLO у видов Brassicaceae…...… 254
6.3.6 Обсуждение и выводы…………………………………. 255
6.4 Молекулярные инструменты для изучения растений из рода
Boechera: трансформация, микродиссекция с лазерным захватом
и транскриптомика…………………………………………………... 259
6.5 Ресурсы для геномных исследований рода Boechera и проблемы
анализа генома………………………………………………………. 263
6.6 Сборка генома Boechera retrofracta……………………………. 273
6.6.1 Статистика на основе k-mer анализа…………………. 274
6.6.2 Сборка и оценка генома………………………………... 275
6.6.3 Аннотация повторов, поиск вариантов и
генотипирование……………………………………………... 276
6.6.4 Предсказание белок кодирующих генов и нкРНК…… 278
6.6.5 Реконструкция дерева видов…………………………... 278
6.6.6 Полногеномное сравнение……………………………... 279
6.6.7 Обсуждение и выводы…………………………………. 280
6.7 Сборка высоко гетерозиготного генома и хромосомный анализ
апомиктического растения Boechera………………………………. 283
8
Глава 7. Эпигенетические модификации при размножении и развитии
растений……………………………………………………………………. 288
7.1 Эпигенетические системы у растений…………………………. 288
7.2 Метилирование при развитии меристемы…………………...... 291
7.3 Эпигенетическая регуляция микроспорогенеза и развития
мужского гаметофита………………………………………………. 294
7.4 Эпигенетическая регуляция мегаспорогенеза и развития
женского гаметофита………………………………………………. 296
7.5 Роль эпигенетических изменений при оплодотворении,
эмбриогенезе и эндоспермогенезе. Импринтированные гены...…. 297
7.6 Эпигенетическое наследование последующими поколениями.
Апомиктическое и бесполое размножение………………………... 299
Экспериментальные процедуры…………………………………………... 307
Заключение…………………………………………………………………. 346
Выводы ……………………………………………………………………. 354
Список сокращений………………………………………………………... 357
Список литературы………………………………………………………… 361
