ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .................... 5
ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................ 7
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ................................................................... 15
1.1 СОВРЕМЕННЫЕ СПОСОБЫ МОДИФИКАЦИИ
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ .......................................................................... 15
1.1.1 Олигонуклеотидный синтез ......................................................................... 17
1.1.2 Химические модификации ........................................................................... 26
1.1.2.1 Модификации межнуклеотидной связи ................................ 27
1.1.2.2 Модификация азотистых оснований нуклеотидов .............. 32
1.1.2.3 Модификация рибозы ............................................................. 34
1.2 СЕКВЕНИРОВАНИЕ ТРАНСКРИПТОМА ЕДИНИЧНОЙ КЛЕТКИ 39
1.2.1 Секвенирование нового поколения (NGS) ................................................ 40
1.2.1.1 Секвенирование короткими прочтениями. ....................................... 41
1.2.1.2 Секвенирование длинными прочтениями ........................................ 44
1.2.2 Изучение транскриптома единичной клетки с помощью современных
методов анализа ....................................................................................................... 46
1.2.2.1 Изоляция клеток и амплификация клеточных РНК-
транскриптов ................................................................................................... 48
1.2.2.2 Молекулярное мечение........................................................... 49
1.2.2.3 Анализ данных секвенирования транскриптома единичной
клетки ................................................................................................... 51
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ......................... 54
2.1 Твердофазный синтез олигонуклеотидов ..................................................... 54
3
2.2 Модификация твердофазного носителя ПЭГ-спейсером и PC-линкером 55
2.3 Синтез баркодированной олигонуклеотидной последовательности ....... 55
2.3.1 Формирование клеточного баркода методом «split-and-pool» .......... 55
2.3.2 UMI баркод ............................................................................................. 56
2.4 Фотолиз баркодированных олигонуклеотидов ............................................ 56
2.5 Подтверждение синтеза баркода методом «split-and-pool» с помощью биологических методов .......................................................................................... 57
2.5.1 Лигирование продуктов амплификации в вектор pGEM-T Easy (или pAL-2T) ................................................................................................... 57
2.5.2 Трансформация клеток E.coli и высев на селективную среду ........... 57
2.5.3 Отбор клонов методом бело-голубой селекции с последующей проверкой методом ПЦР ................................................................................ 58
2.5.4 Определение нуклеотидной последовательности баркода ................ 58
2.6 Приготовление эмульсии вода-в-масле и инкапсуляция клеток и частиц с олигонуклеотидами ................................................................................................. 58
2.7 Проведение обратной транскрипции в эмульсии и подготовка библиотеки ДНК-фрагментов к секвенированию ............................................. 59
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ................................................................................. 63
3.1 Разработка методики синтеза олигонуклеотидной последовательности ................................................................................................ 63
3.2 Применение Photo-Cleavable-линкера для фоторелиза олигонуклеотидной последовательности ............................................................ 73
3.3 Пространственный фактор в работе полимеразы при амплификации и синтезе кДНК методом обратной транскрипции ............................................... 79
3.4 Создание баркодированной вставки в синтетическом олигонуклеотиде «split-and-pool» методом ........................................................................................ 82
4
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ ................ 86
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................... 95
ВЫВОДЫ ......................................................................................................... 97
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ . 98
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................. 100
