СОДЕРЖАНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ ....................................................................................................................................... 5
2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР ............................................................................................................ 10
2.1. Гипоксия опухоли ....................................................................................................................... 10
2.2. Энергообеспечение клеток в нормальных условиях и при гипоксии .................................... 14
2.3. Кислотность у поверхности раковых клеток ............................................................................ 16
2.4. Лечение, направленное на опухолевый ацидоз ........................................................................ 17
2.4.1. Вмешательство в системы регулирования pH. .............................................................. 17
2.4.2. Воздействие на внеклеточную кислотность опухоли. .................................................. 19
2.4.3. рН-чувствительные системы доставки лекарств для нацеливания на опухоль. ......... 19
2.5. pHLIP–технология ....................................................................................................................... 20
2.5.1. Пептиды семейства pHLIP и их механизм действия ..................................................... 20
2.5.2. Варианты pHLIP ................................................................................................................ 22
2.5.3. pHLIP как инструмент для диагностики и визуализации микроокружения опухоли 23
2.5.4. pHLIP как переносчик низкомолекулярных токсинов и лекарств в опухолевые клетки.
....................................................................................................................................................... 25
2.5.5. Доставка генетического материала (пептидно-нуклеиновых кислот) при pHLIP ..... 27
2.5.6. Адресная доставка наноматериалов при помощи pHLIP .............................................. 29
2.5.7. Доставка к опухоли пептидных и белковых нагрузкок при помощи pHLIP .............. 37
2.5.8. Терапевтические агенты на основе слияния белков и pHLIP ....................................... 39
2.5.9. Ограничения pHLIP-технологии ..................................................................................... 41
2.5.10. Неопухолевые применения технологии pHLIP............................................................ 42
3. МАТЕРИАЛЛЫ И МЕТОДЫ ....................................................................................................... 43
3.1. Реактивы и материалы .............................................................................................................. 43
3.2. Методы ....................................................................................................................................... 44
3.2.1. Приготовление компетентных клеток ............................................................................ 44
3.2.2. Трансформация плазмидной ДНК ................................................................................... 45
3.2.3. Выделение плазмидной ДНК ........................................................................................... 45
3.2.4. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле ................................................... 45
3.2.5. Амплификация ДНК методом ПЦР ................................................................................ 45
3.2.6. Очистка амплифицированных фрагментов ДНК из реакционной смеси .................... 46
3.2.7. Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции ........................................................... 46
3.2.8. Лигирование молекул ДНК .............................................................................................. 46
3
3.2.9. Наработка биомассы для выделения белков .................................................................. 46
3.2.10. Выделение белков ........................................................................................................... 46
2.3.11. Денатурирующий электрофорез в денатурирующем полиакриламидном геле
(ПААГ) ......................................................................................................................................... 47
3.2.12. Гель-фильтрация белков ................................................................................................ 47
3.2.13. УФ-видимая спектрофотометрия .................................................................................. 47
3.2.14. Культивирование клеточных линий .............................................................................. 47
3.2.15. Конфокальная микроскопия .......................................................................................... 48
3.2.16. Проточная цитофлуореметрия ....................................................................................... 48
3.2.17. Анализ жизнеспособности клеток ................................................................................. 49
3.2.18. Ингибирование эндоцитоза ............................................................................................ 49
3.2.19. Оценка фототоксичности ............................................................................................... 50
3.2.20. Определение фотоцитотоксичности при помощи окрашивания клеток трипановым
синим ............................................................................................................................................ 51
3.2.21. Генерация АФК в кювете ............................................................................................... 51
3.2.22. Генерация АФК в живых клетках ................................................................................. 52
3.2.23. Гель-фильтрационный анализ белков для определения олигомерного состояния .. 52
3.2.24. Анализ распределения гибридной конструкции на модели in vivo ........................... 52
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ................................................................................................ 54
4.1. Гибридные конструкции флуоресцентого белка EGFP с пептидами pHLIP ...................... 55
4.1.1. Дизайн и получение генетически кодируемых конструкций EGFP/pHLIP ................ 55
4.1.2. Подбор оптимальных условий тестирования конструкций EGFP/pHLIP ................... 57
4.1.3. рН-зависимое связывание гибридных конструкций с клеточной мембраной по
данным флуоресцентной микроскопии .................................................................................... 59
4.1.4. рН-зависимое связывание конструкций EGFP/pHLIP с клетками HeLa по результатам
анализа методом проточной цитометрии ................................................................................. 61
4.1.5. Изучение интернализации EGFP-pHLIPwt клетками HeLa .......................................... 63
4.2. Гибридная конструкция на основе белка miniSOG и пептида pHLIP ................................. 66
4.2.1. Разработка белково-пептидной фотосенсибилизирующей системы ........................... 66
4.2.2 pH-зависимое связывание miniSOG-pHLIPwt с клетками HeLa ................................... 67
4.2.3. Изучение фотоцитотоксичности miniSOG-pHLIPwt на клеточной модели HeLa ...... 70
4.3. Влияние линкерных последовательностей на свойства конструкций EGFP/pHLIP ............ 73
4.3.1. Эффективность созревания хромофора флуоресцентного белка в конструкциях
EGFP/pHLIP. ................................................................................................................................ 74
4.3.2. рН-зависимое связывание конструкций EGFP/pHLIP с клетками HeLa согласно
данным проточной цитофлуориметрии. ................................................................................... 75
4
4.3.3. рН-зависимое связывание конструкций EGFP/pHLIPwt с клетками HeLa по данным
флуоресцентной микроскопии ................................................................................................... 77
4.4. Влияние линкерных последовательностей на свойства конструкций mCherry/pHLIP ........ 79
4.4.1. Дизайн конструкций на основе mCherry и пептидов pHLIP ........................................ 79
4.4.2. Эффективность созревания хромофора флуоресцентного белка гибридных
конструкций. ................................................................................................................................ 80
4.4.3. Изучение эффективность pH-зависимого связывания гибридных конструкций. ...... 81
4.4.4. Изучение олигомерного состояния гибридных конструкций. ..................................... 83
4.4.5. Изучение распределения конструкции mCherry-15-ATRAM в организме модельного
животного. ................................................................................................................................... 83
4.5. Влияние природы нагрузки на рН-специфичность пептида ATRAM. .................................. 85
4.6. Новый подход к получению оптимальных конструкции белков с пептидами pHLIP ......... 88
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ .............................................................................................................................. 92
6. ВЫВОДЫ ........................................................................................................................................ 95
7. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ................................ 96
8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ............................................................................................................ 98
9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................................................ 100
10. ПРИЛОЖЕНИЕ .......................................................................................................................... 120
