Введение
1 Обзор литературы 11
1.1 Современные представления о цитокинах 11
1.1.1 Классификация и функции цитокинов 11
1.1.2 Цитокиновые рецепторы и общий механизм внутриклеточной передачи сигнала 15
1.2 Цитокины как медиаторы иммунного ответа 19
1.2.1 Цитокины и иммунный ответ при вирусных инфекциях 19
1.2.2 Роль цитокинов в иммунном ответе на инфекцию вирусом гриппа 27
1.3 Современные методы определения цитокинов 32
1.3.1 Особенности проведения анализа цитокинов 32
1.3.2 Методы выявления цитокинов 33
1.3.3 Технология микрочипов 35
2 Материалы и методы 44
2.1 Объекты 44
2.1.1 Клеточные культуры 44
2.1.2 Вирусы 45
2.2 Вирусологические методы 45
2.2.1 Определение инфекционной активности вируса 45
2.2.2 Стимуляция клеток ВГА 46
2.3 Иммунологические методы 46
2.3.1 «Сэндвич»-ИФА 46
2.3.2 Мультиплексный «сэндвич»-вариант МФА в формате микрочипа 47
2.4 Молекулярно-генетические методы 49
2.4.1 Экстракция РНК 49
2.4.2 Обратная транскрипция 49
2.4.3 Полимеразная цепная реакция 49
2.4.4 Электрофоретическое разделене ДНК в агарозном геле 50
2.4.5 Печать олигонуклеотидного микрочипа 50
2.4.6 Подготовка пробы кДНК для гибридизации методом ОТ-ПЦР 51
2.4.7 Подготовка пробы амплифицированной мРНК для гибридизации методом ОТ-IVT 51
2.4.8 Подготовка библиотек кДНК для гибридизации с использованием набора MINT 52
2.4.9 Гибридизация на олигонуклеотидном микрочипе 52
2.4.10 Мультиплексная ПЦР с детекцией в режиме реального времени 53
2.4.11 Детекция вирусной РНК методом ПЦР 54
2.5 Методы вычислительной биологии 54
2.5.1 Филогнетический анализ гена NS1 вируса гриппа типа А 54
2.5.2 Общие стратегии при конструировании олигонуклеотидных зондов и праймеров 55
2.5.3 Анализ изображения, получаемого после гибридизации 56
2.5.4 Анализ результатов мПЦР 57
2.5.5 Статистические методы анализа 57
3 Результаты собственных исследований и их обсуждение 58
3.1 Выбор штаммов вирусов гриппа А и клеточной модели для изучения особенностей экспрессии цитокинов 58
3.2 Разработка олигонуклеотидного микрочипа для выявления мРНК цитокинов и его применение для изучения роли белка NS1 вируса гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1) в индукции цитокинового ответа 64
3.2.1 Подбор олигонуклеотидных зондов и праймеров для мРНК цитокинов-мишеней IL 1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN-, TNF- человека з
3.2.2 Создание лабораторного образца олигонуклеотидного микрочипа для анализа экспрессии цитокинов и выбор условий проведения основных этапов гибридизации 66
3.2.3 Выбор условий проведения основных этапов гибридизации на олигонуклеотидном микрочипе 68
3.2.4 Оценка аналитической чувствительности олигонуклеотидного микрочипа 70
3.2.5 Выбор способа подготовки флуоресцентно меченой пробы для анализа на микрочипе на примере клеток А549, инфицированных вирусом гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1). 71
3.2.6 Анализ роли белка NS1 вируса гриппа A/Kurgan/5/05 (H5N1) в индукии цитокиновго ответа в клетках А549 методом олигонуклеотидного микрочипа и ОТ-ПЦР 75
3.3 Разработка метода определения уровня цитокинов с использованием мультиплексной
ПЦР в режиме реального времени 77
3.3.1 Подбор праймеров и TaqMan зондов и оптимизация условий проведения реакции мультиплексной ПЦР в режиме реального времени для выявления IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, IFN-, TNF- человека 77
3.3.2 Проверка валидности системы мПЦР для оценки экспрессии цитокинов 83
3.4 Сравнение паттернов экспрессии мРНК цитокинов в клетках A549, инфицированных вирусами гриппа A/H1N1pdm09, А/H3N2 и А/H5N1, методом мультиплексной ПЦР 86
3.5 Разработка белкового микрочипа для количественного выявления цитокинов 91
3.5.1 Выбор моноклональных антител и рекомбинантных цитокинов для использования в микрочипе 91
3.5.2 Дизайн белкового биочипа для выявления IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IFN- и TNF- человека. 92
3.5.3 Анализ специфичности и чувствительности белкового микрочипа с помощью рекомбинантных цитокинов 95
3.5.4 Анализ влияния гена NS1 вируса гриппа А/H5N1 на спектр цитоконов, секретируемых клетками МКПК методами биочипа и традиционного ИФА 98
3.6 Анализ особенностей экспрессии цитокинов клетками A549 на уровне транскрипции и
на уровне трансляции при заражении вирусом гриппа A/California/07/09 (H1N1pdm09) 99
Заключение 103
Выводы 106
Список сокращений и условных обозначений 107
Список литературы 108
