Введение
Обзор литературы 10
1.1 Кристаллизация рибосом и их субчастиц, кристаллографические исследования и определение структур 10
1.2 Малая рибосомная субчастица рибосомы 13
1.2.1 Структурные и функциональные особенности малой субчастицы 13
1.2.2 Декодирующий центр 14
1.2.3 Морфологические элементы малой субчастицы 15
1.2.4 Структура 30S субчастицы в комплексе с антибиотиками 16
1.3 Большая рибосомная субчастица 18
1.3.1 Структура и функциональные центры большой субчастицы рибосомы 18
1.3.2 Структура РНК большой рибосомной субчастицы 18
1.3.3 Пептидилтрансферазный центр 22
1.3.4 ПТЦ - проторибосома 24
1.3.5 Центр, ассоциированный с ГТФазной активностью (ГАЦ) 25
1.3.6 Белки большой субчастицы 25
1.3.7 Структура 50S субчастицы в комплексе с антибиотиками 27
1.4 Структура 70S рибосомы 28
1.4.1 Межсубъединичные мостики 32
1.5 Элонгационный цикл и функциональные центры рибосомы 36
1.5.1 тРНК-связывающие сайты 36
1.5.1.1 А-сайт 36
1.5.1.2 P-сайт 39
1.5.1.3 Е-сайт 40 1.5.2 Инициация 41
1.5.3 Элонгация и декодирующий центр 44
1.5.4 Формирование пептидной связи 47
1.5.5 Транслокация 48
1.5.6 Терминация 49
1.5.7 Рибосома – молекулярная машина 51
1.6 Рибосомный белок L1 как составная часть L1-выступа и регулятор синтеза белков своего оперона 52
1.6.1 Белок L1, как составная часть L1-выступа 52
1.6.2 Белок L1 - репрессор, ингибирующий трансляцию мРНК своего оперона 55
Материалы и методы 61
2.1 Материалы 61
2.1.1 Химические реактивы и ферменты 61
2.1.2 Буферы 61
2.1.3 Среды 62
2.1.4 Бактериальные штаммы и плазмиды 62
2.1.5 Приборы 62
2.2 Методы 63
2.2.1 Методы генной инженерии и микробиологии 63
2.2.1.1 Полимеразная цепная реакция 63
2.2.1.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле 64
2.2.1.3 Обработка ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами 64
2.2.1.4 Очистка фрагментов ДНК 64
2.2.1.5 Лигирование ДНК 65
2.2.1.6 Получение компетентных клеток 65
2.2.1.7 Трансформация клеток E. coli 65
2.2.1.8 ПЦР-анализ клонов 65
2.2.1.9 Выделение и очистка плазмидной ДНК 66 2.2.1.10 Рестрикция плазмидной ДНК для транскрипции и ее последующая очистка 66
2.2.1.11 Экспрессия генов белка L1 и его мутантных форм в клетках Е. coli 66
2.2.2 Выделение и очистка белков 67
2.2.2.1 Выделение белка L1 из клеток Е. coli 67
2.2.2.2 Катионообменная хроматография на смоле СМ-Sepharosе 67
2.2.2.3 Аффинная хроматография на смоле Heparin- Sepharosе 67
2.2.2.4 Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН 68
2.2.2.5 Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях 68
2.2.2.6 Проверка наличия/отсутствия РНКазной активности в полученном препарате белка 69
2.2.3 Выделение и очистка РНК 69
2.2.3.1 Получение специфических фрагментов рРНК 69
2.2.3.2 Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях 70
2.2.3.3 Электрофорез нуклеиновых кислот в ПААГ в неденатурирующих условиях 71
2.2.4 Получение и кристаллизация мутантных форм белка L1 и РНК-белкового комплекса 71
2.2.5 Анализ РНК-белковых комплексов методом поверхностного плазмонного резонанса 71
2.2.5.1 Биотинилирование фрагментов РНК 71
2.2.5.2 Модификация поверхности чипа 72
2.2.5.3 Определение констант ассоциации и диссоциации методом поверхностного плазмонного резонанса 73
Результаты и их обсуждение 74
3.1 Пространственная структура изолированного полноразмерного L1-выступа рибосомы 74
3.1.1 Получение и кристаллизация комплекса TthL1-рРНК 75
3.1.1.1 Клонирование гена специфического фрагмента рРНК 75
3.1.1.2 Получение фрагмента рРНК 76 3.1.1.3 Выделение и очистка рибосомного белка L1 76
3.1.1.4 Электрофоретический анализ комплексов белка L1 с фрагментами рРНК 3.1.1.5 Кристаллизация полноразмерного L1-выступа 79
3.1.2 Анализ структуры комплекса TthL1-рРНК 80
3.1.2.1 Структура фрагмента 23S рРНК 80
3.1.2.2 Взаимодействие белка L1 и рРНК в полноразмерном L1-выступе рибосомы 82
3.1.2.3 Вероятная роль спирали Н78 23S рРНК и домена II рибосомного белка L1 в функционировании рибосомы 83
3.1.2.4 Кинетический анализ комплексов белка L1 с фрагментами рРНК 84
3.1.2.5 Влияние неконсервативных взаимодействий на сродство L1 к РНК 86
3.2 Структурно-кинетические исследования влияния замен консервативного Тhr217 на РНК-связывающие свойства белка и его структуру, как в свободном состоянии, так и в комплексе с РНК 88
3.2.1 Кинетический анализ взаимодействий мутантных форм белка L1 со специфическим фрагментм РНК 88
3.2.2 Кристаллизация белка TthL1 с заменой Thr217Val иего комплекса с РНК 89
3.2.3 Анализ структур TthL1 Thr217V и TthL1 Thr217V-рРНК 91
3.2.4 Кристаллизация TthL1 с заменой Thr217Ala в комплексе с РНК 91
3.2.5 Анализ структуры TthL1 Thr217Аla-рРНК 92
3.3 Роль N-концевой спирали 1 TthL1 во взаимодействии белка с РНК 92
3.4. Влияние С-концевых положительно заряженных аминокислотных остатков архейного белка L1 на взаимодействие белка с РНК 96
3.4 Влияние электростатических взаимодействий на формирование и стабильность комплексов рибосомного белка L1 с РНК 100
Выводы: 105
Список литературы 106
