Список используемых сокращений ................................................................... 3
Введение .................................................................................................................. 6
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................... 12
1.1. Общие сведения о флуоресцентных белках .......................................... 12
1.2. Фототрансформируемые флуоресцентные белки ................................. 16
1.2.1. Фотопереключение ............................................................................... 17
1.2.2. Фотоактивация ...................................................................................... 23
1.2.3. Фотоконверсия ...................................................................................... 25
1.2.4. Фотодеструкция .................................................................................... 27
1.3. Практическое применение явления фотопревращения ........................ 29
1.4. Бесцистеиновые флуоресцентные белки................................................ 33
1.5. Моделирование процессов фотопревращений ...................................... 35
1.6. Объект исследования ............................................................................... 37
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ......................... 41
2.1. Реактивы и материалы ................................................................................ 41
2.2. Общие методики ......................................................................................... 44
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ ........................................... 64
3.1. Подбор условий для очистки флуоресцентного белка SAASoti хроматографическими методами...................................................................... 64
3.2. Роль остатков цистеина в аллостерической модуляции фототрансформаций mSAASoti ........................................................................ 67
3.2.1. Анализ остатков цистеина, находящихся на поверхности ............... 67
3.2.2. Анализ остатков цистеина, находящихся «внутри» β-бочонка SAASoti ............................................................................................................ 70
3.3. Получение кристаллической структуры белка SAASoti......................... 79
3.3.1. Получение мутантной формы mSAASoti для последующих структурных исследований ............................................................................ 79
3.4. Молекулярное моделирование вариантов mSAASoti, содержащих замены аминокислотных остатков цистеина .................................................. 83
3.4.1. Увеличение pKa хромофора красной формы ..................................... 83
3.4.2. Влияние замены C175A на скорость релаксации зеленой формы ... 85
3.5. Получение яркой формы mSAASoti ......................................................... 86
2
3.6. Получение мутантных форм mSAASoti с повышенной скоростью фотопереключения ............................................................................................. 88
3.6.1. Характеристика физико-химических и флуоресцентных параметров мутантных форм с заменами в положении 163 и 177 ................................. 89 3.6.2. Причина уширения спектров поглощения ......................................... 90 3.6.3. Изучение обратимого переключения полученных мутантных форм mSAASoti ......................................................................................................... 92 3.6.4. Визуализация клеточных структур с использованием мутантных форм mSAASoti ............................................................................................... 99
3.7. Происхождение фотопереключения во флуоресцентных белках ........ 103
Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................. 105
ВЫВОДЫ ............................................................................................................ 115
Публикации по теме работы ........................................................................... 116
ПРИЛОЖЕНИЕ ................................................................................................. 134
