Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8
1.1. Общее представление о системах рестрикции-модификации 8
1.2. Разнообразие эндонуклеаз рестрикции типа II 13
1.3. Взаимодействие эндонуклеаз типа П с узнаваемой последовательностью 15
1.4. Пространственная структура эндонуклеаз рестрикции типа Я 25
1.5. Биологическая роль систем рестрикции-модификации 33
1.6. Никующие зндонуклеазы 36
1.6.1. Искусственные никазы 39
Получение никаз с нарушенным димеризациоиным интерфейсом 39
Получение никаз путем инактивации одного из каталитически сайтов 42
Никование ДНК с использованием пептидных олигопуклеотидое 43
1.6.2. Практическое применение сайт-специфических никаз 44
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 50
2.1. Материалы 50
2,3 Методы 57
Рассчет значений индекса кодонового соответствия 57
Выделение пяатидной ДНК из E.coli 58
НИР-амплификация 58
Очистка ДНК на Silica 59
Выделение двухцепочечпой формы ДНК фага на основе М13 (мини-преп) 59
Выделение двухцепочечпой формы ДНК фага на основе МП (макси-преп) 60
Выделение одноцепочечгюй формы ДНК фага на основе МП 60
Скрининг рекомбинантных клонов при помощи ПНР с колоний 61
Электрофорез белков в ПААГ 61
Получение компетентных клеток Е. coli 61
Трансформация компетентных клеток Е. coli 62
Индукция экспрессии генов в клетках Е. coli 63
Получение фага ХСЕ6 64
Определение титра фага 64
Проверка способности фага 1СЕ6 активировать транскрипцию с промотора фага Т7 64
Получение клеток BL2J, не чувствительных к присутствию метилаз 65
Выделение ииказы N.BspD6I 65
Определение активности никазы 61
Метод NMB-анализа 68
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 69
3.1 Получение суперпродуцента никазы 69
3.1.1.1 Іолучсние продуцента ииказы на основе ішеток Е. co/ZTOPlOF 69
3.1.2. Определение влияния кодоиового состава на уровень экспрессии белка 71
3.1.3.Создание генетической конструкции, несущей одновременно гены редких транспортных РНК и ДНК-метиптрансферазы SscLH 76
3.1.4, Конструирование продуцента никазы на основе клеток c0/(BL21(DE3) 80
3.2. Выделение никазы 83
3.3. Определение пространственной структуры никазы 86
3.3.1, Кристаллизация никазы 86
3.3.2, Определение пространственной структуры никазы 88
3.4. Анализ пространственной структуры никазы 89
3.4.1. Субдомен 1 N-концевого домена никазы 90
3.4.2. Субдомен 2N-концевого домена никазы 91
3.4.3. Динкерный домен 92
3.4.4. С-концевой домен 93
3.4.5. Каталитический центр никазы 94
3.4.6. Моделирование комплекса никазы с ДНК 96
3.5. Метод детекции нуклеиновых кислот с помощью молекулярных биконов и никазы 102
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 109
5. ВЫВОДЫ 113
6. Список публикаций по материалам диссертационной работы 114
8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115
