Введение
1. Обзор литературы 11
1.1. Общие сведения о геморрагической лихорадке с почечным синдромом 11
1.2. Молекулярная биология, филогения и разнообразие хантавирусов 12
1.2.1. Соответствие различных серотипов хантавирусов определенным хозяевам-переносчикам 12
1.2.2. Особенности организации генома хантавирусов 16
1.2.3. Синтез вирусной РНК и созревание вирионов 22
1.3. Диагностика ГЛПС 25
1.3.1. Метод флюоресцентных антител 27
1.3.2. Иммуно-пероксидазное окрашивание 28
1.3.3. Иммуноферментный анализ 29
1.3.4. Иммунохроматографические тесты 30
1.3.5. Полимеразная цепная реакция 31
1.3.5.1. ОТ-ПЦР, «гнездовая» ОТ-ПЦР 32
1.3.5.2. ПЦР в реальном времени 34
1.3.5.3. ЛЦР в реальном времени 46
2. Объект и методы исследований 49
2.1. Краткая характеристика объектов исследований 49
2.2. Выделение и очистка плазмидной ДНК 49
2.3. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 51
2.4. Выделение и очистка РНК из аутопсийных тканей 52
2.5. Синтез кДНК 52
2.6. Полимеразная цепная реакция в реальном времени 53
2.7. Фосфорилирование 5-концов олигонуклеотидных праймеров 53
2.8. Получение одинарных и двойного олигонуклеотидных дуплексов и определение их температуры плавления 54
2.9. ЛЦР или ОТ-ЛЦР в режиме реального времени 55
2.10. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 55
2.11. Реактивы и материалы 56
2.12. Составы использованных стандартных растворов 57
3. Результаты исследований и их обсуждение 58
3.1. Реакции с плазмидной ДНК 58
3.1.1. Характеристика объекта исследований 58
3.1.2. Проверка плазмиды pCRII на наличие вставки 59
3.1.3. Подбор праймеров и оптимизация параметров ПЦР и ЛЦР в реальном времени 60
3.1.4. Проведение ПЦР и ЛЦР с оптимизированными параметрами реакций 65
3.2. Проведение ОТ-ПЦР и ОТ-ЛЦР на синтетической матрице 67
3.2.1.nLlPcSYBRGreenlHFAM/ROX 67
3.2.2.ЛЦРс8УВІІОгеепІиРАМ/ІІОХ 75
3.3. ПЦР-РВ и ЛЦР-РВ с препаратами, содержащими вирусную РНК 77
3.3.1. Реакции с построением кДНК 77
3.3.1.1. ОТ-ПЦР с ST-pol 78
3.3.1.2. ОТ-ПЦР с M-MLV-revertase/Tth-pol 83
3.3.2. Реакции на РНК-матрице 84
3.3.2.1. ЛЦР на РНК (четыре праймера) 84
Заключение 88
