Введение
1. Обзор литературы 10
1.1 Структура полисахаридов растительных клеточных стенок 10
1.1.1. Целлюлоза 11
1.1.2. Лигнин 12
1.1.3. Гемицеллюлозы 13
1.1.3.1. Р-Глюканы 15
1.1.3.2. Ксилоглюкан 15
1.1.3.3. Ксилан 16
1.1.3.4. Галактоманнан, галактоглюкоманнан 18
1.1.4. Пектин 19
1.2. Ксиланазы мицелиальных грибов 20
1.2.1. Молекулярная масса 20
1.2.2. Температурный и рН оптимум грибных ксиланаз, классификация 21
1.2.3. Субстратная специфичность и продукты расщепления 24
1.2.4. Побочные активности грибных ксиланаз 26
1.2.5. Структура ксиланаз 10 и И семейства 27
1.2.6. Аминокислотные последовательности грибных ксиланаз и структуры кодирующих их генов 28
1.2.7. Посттрансляционная модификация ксиланаз 29
1.3. Регуляция транскрипции генов ксиланаз мицелиальных грибов 29
1.3.1. Aspergillus 30
1.3.2. Регуляторы транскрипции ксиланазных генов Aspergillus XlnR и CreA 32
1.3.3. Координированная экспрессия арабиназных генов Л. niger 36
1.3.4. Trichoderma 36
1.3.5. Регуляторы транскрипции ксиланазных генов Т. reesei 37
1.3.6. Регуляция промотора xynl Т. reesei 39
1.3.7. Регуляция промоторахуп2 Т. reesei 40
1.3.8. Penicillium 42
1.3.9. Регуляция транскрипции генов ксиланаз в зависимости от рН среды 43
1.4. P. canescens F178 (ВКПМ) 44
2. Материалы и методы 47
2.1. Реактивы, плазмидные вектора, ферменты и материалы 47
2.2. Бактериальные и грибные штаммы, их культивирование 47
2.3. Общие методы 48
2.4. Исследование ростовых характеристик грибов 48
2.5. Электрофоретическое разделение белков 48
2.6. Получение [а-32Р]-меченных фрагментов ДНК 48
2.7. Выделение ДНК из грибного мицелия 49
2.8. Выделение РНК из грибного мицелия 51
2.9. Обратная транскрипция РНК и ОТ-ПЦР 53
2.10. Электрофорез РНК и перенос на нейлоновую мембрану 53
2.11. Гибридизация 53
2.12. Плазмидная трансформация Е. coli 54
2.13. Скрининг фаговой библиотеки генов и анализ ДНК рекомбинантных фагов 55
2.14. Трансформация гриба Penicillium canescens 56
2.15. Компьютерные программы для анализа нуклеотидных последовательностей ДНК 56
2.16. ПЦР с использованием грибных спор в качестве матрицы 57
2.17. Измерение активностей ферментов 57
2.18. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 58
2.19. Клонирование xylA P. canescens 58
2.20. Получение кДНК xylA и определение ее нуклеотидной последовательности 59
2.21. Определение числа копий xylA в геноме мультикопийного продуцента 60
2.22. Клонирование xlnR P. canescens 60
2.23. Делеция xlnR 63
2.24. Синтез праймеров для амплификации фрагмента гена у-актина P. canescens 66
3. Результаты и их обсуждение 67
3.1. Ксиланаза А 67
3.1.1. Клонирование гена, кодирующего мажорную эндо-1,4-бета-ксиланазу Penicillium canescens 67
3.1.2. Определение структуры xylA 71
3.1.4. Сравнение свойств ксиланазы, производимой однокопийным и мультикопийным штаммами 75
3.1.5. Индукция синтеза ксиланазы мицелиальным грибом P. canescens 77
3.1.6. Влияние суперпродукции ксиланазы на продукцию других внеклеточных ферментов 79
3.2. Ксиланаза В 81
3.3. Клонирование гена P. canescens, кодирующего регулятор транскрипции ксиланолитических генов 85
3.3.1. Анализ геномной ДНК P. canescens и клонирование гена 85
3.3.2. Влияние делеции и амплификации xlnR на продукцию ксиланазы и рост штамма 87
3.3.3. Роль xlnR в регуляции продукции других ферментов 90
3.3.4. Транскрипция х/гс/? 92
Выводы 94
