Введение
1 Рибонуклеаза sa, родственные ферменты и их ингибиторы 7
1.1. Принципы классификации нуклеаз 7
1.2. Механизм каталитического действия циклизующих рибонуклеаз 7
1.3. Структура и свойства РНКазы Sa и подобных ей РНКаз 9
1.3.1. Структура и механизм действия РНКазы Sa 10
1.3.2. Каталитические свойства РНКазы Sa и ее гомологов 12
1.3.3. Термостабильность РНКазы Sa, ее гомологов и мутантов 17
1.4. Влияние остатков активного центра на стабильность белка 21
1.5. Ингибиторы рибонуклеаз 24
1.5.1. Низкомолекулярные ингибиторы РНКаз 24
1.5.2. Белковые ингибиторы РНКаз 27
1.5.2.1. Барстар 27
1.5.2.2. Цитоплазматический ингибитор рибонуклеаз животного происхождения 29
1.6. Цитотоксичность РНКаз 31
1.6.1. Токсическое действие РНКазы на клетку 32
1.6.2. Молекулярные детерминанты цитотоксичности РНКаз 34
2. Материалы и методы исследований 39
2.1. Объекты и материалы 39
2.1.1. Бактериальные рибонуклеази 39
2.1.2. Барстар А и его мутанты 42
2.1.3. Получение З-Ы-гидроксиуреидо-З-дезокситимидин 5-фосфата 43
2.1.4. Использованные реагенты 45
2.2. Методы исследований 45
2.2.1. Измерение каталитических параметров реакций гидролиза субстратов РНКазами 45
2.2.2. Определение жизнеспособности клеток в присутствии РНКазы 46
2.2.3. Дифференциальная Сканирующая Калориметрия (ДСК) 47
2.2.4. Круговой Дихроизм (КД) 49
2.2.5. Измерение констант связывания 50
2.2.6. Определение концентраций 50
З. Результаты и обсуждение 51
3.1. Структурно-функциональный анализ активного центра РНКазы Sa 51
3.1.1. Роль остатков GIn38 и GIu41 в связывании субстрата 54
3.1.2. Функциональная роль остатков Glu54, Arg65, His85 и Glu74 56
3.1.3. Влияние изменения общего заряда молекулы РНКазы Sa на ее активность 60
3.2. Конструирование ингибиторов РНКазы Sa и родственных ферментов 65
3.2.1. Ингибирование РНКаз металлохелатами 65
3.2.2. Ингибирование активностей РНКазы Sa и биназы З-М-гидроксиуреидо-З-дезокситнмидин 5-фосфатом в присутствии цинка(Н) 67
3.2.3. Ингибирование активности Glu54Gln мутанта РНКазы Sa З-М-гидроксиуреидо-З-дезокситимидин 5-фосфатом в присутствии цинка(П) 72
3.3. Изучение вклада остатков активного центра РНКазы Sa в конформационную стабильность фермента 76
3.4. Цитотоксические свойства РНКазы Sa, ее близких гомологов и мутантов с измененным зарядом 82
3.4.1. Изменение общего заряда молекулы с отрицательного на положительный делает РНКазу Sa цитотоксичиой 83
3.4.2. Роль активируемых кальцием калиевых (Кса) каналов в преодолении цитотоксичности, индуцированной РНКазами 87
3.4.3. Положительный заряд является основной детерминантой цитотоксичности микробных РНКаз 90
Выводы 92
