Введение
1. Обзор литературы 9
1.1. Подходы in vivo (методы, использующие клетки) 9
1.1.1. Фаговый дисплей 9
1.1.2. Дисплей на поверхности клеток 12
1.1.3. «Пептиды на плазмидах» 14
1.1.4. Преимущества и недостатки дисплеев in vivo 15
1.2. Подходы in vitro (бесклеточные методы) 16
1.2.1. Дисплеи, где белок связан с РНК 16
1.2.1.1. Нековалентная связь мРНКс белком 16
1.2.1.2. Ковалентная связь мРНК с белком 20
1.2.2. Дисплеи, где белок связан с ДНК 23
1.2.3. In vitro компартментализация 26
1.2.3.1. Простая эмульсия 26
1.2.3.2. Двойная эмульсия 28
1.2.3.3. Особенности метода in vitro компартментализации 30
1.2.4. Преимущества и недостатки дисплеев in vitro 31
2. Материалы и методы 33
2.1. Штаммы Е.СО//И плазмиды 33
2.1.1. Штаммы E.coli 33
2.1.2. Плазмиды 33
2.2. Микробиологические среды 34
2.3. Трансформация клеток E.coli 35
2.4. Выделение и очистка плазмиднои ДНК 36
2.4.1. Грубое выделение плазмиднои ДНК 36
2.4.2. Очистка плазмиднои ДНК при помощи кипячения в присутствии Мд2+и Трис-НСІ (рН 9,0) 37
2.4.3. Фенольная депротеинизация ДНК 38
2.5. Выделение РНК из светляка Luciola mingrelica 39
2.6. Электрофорез нуклеиновых кислоти белков 40
2.6.1. Электрофорез ДНК и РНК в агарозных гелях 40
2.6.2. Электрофорез ДНК и РНК в полиакриламидных гелях 40
2.6.2.1. В денатурирующих условиях 40
2.6.2.2. В неденатурирующих условиях 41
2.6.3. Электрофорез белков в присутствии додецилсульфата натрия 42
2.7. Саузерн-блот анализ 43
2.7.1. Перенос ДНК из геля на мембрану 43
2.7.2. Гибридизация с меченым зондом 43
2.8. Определение концентрации белка -44
2.9. Выделение и очистка термостабильных ДНК-зависимых ДНК-полимераз 45
2.9.1. Получение препарата (НіБ)б-Ри/о-полимеразьі 45
2.9.2. Получение препарата (Ніз)б-Га(7-полимеразьі 47
2.10. Ферментативные реакции 47
2.10.1. Рестрикция 47
2.10.2. Обратная транскрипция (синтез кДНК) 48
2.10.3. Транскрипция 49
2.10.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 49
2.11. Получение экстракта зародышей пшеницы 50
2.11.1. Обработка зародышей пшеницы перед разрушением 50
2.11.2. Разрушение зародышей пшеницы 51
2.11.3. Гель-фильтрация экстракта зародышей пшеницы 51
2.12. Совмещенная транскрипция-трансляция in vitro 52
2.12.1. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта S30 E.coli 52
2.12.2. Транскрипция-трансляция в системе на основе экстракта зародышей пшеницы 53
2.13. Метод молекулярных колоний 54
2.13.1. Подготовка полиакриламидных гелей 54
2.13.2. Полимеразная цепная реакция в геле 55
2.13.3. Транскрипция в геле 56
2.13.4. Совмещенная транскрипция-трансляция в геле 57
2.13.5. Обнаружение колоний ДНК и РНК 57
2.13.5.1. Перенос нуклеиновых кислот из геля на мембрану 57
2.13.5.2. Гибридизация с меченым зондом 58
2.13.6. Детекция белков, синтезированных в геле 58
2.13.6.1. Детекция по включению радиоактивной метки 58
2.13.6.2. Детекция флуоресценции GFP 59
3. Результаты 60
3.1. Цели и экспериментальные задачи 60
3.2. Разработка ПЦР-версии метода молекулярных колоний 61
3.2.1. Выбор иммобилизованной среды 61
3.2.2. Смесь термостабильных ДНК-полимераз 64
3.2.3. Эффективность переноса днк из геля на мембрану 64
3.2.4. Размножение генов обелина и GFP в виде молекулярных колоний 67
3.3. Клонирование in vitro кДНК люциферазы 69
3.3.1. Синтез и размножение кДНК люциферазы в жидкой среде и в геле 69
3.3.2. Отбор и размножение молекулярных клонов 73
3.4. Транскрипция в молекулярных колониях 74
3.5. Синтез белка в молекулярных колониях 76
3.5.1. Выбор системы транскрипции-трансляции 76
3.5.2. Транскрипция-трансляция в геле 78
3.5.3. Проблема несовместимости условий ПЦР и транскрипции-трансляции и ее решение 82
3.5.4. Экспрессия гена GFP в молекулярных колониях 87
4. Обсуждение результатов 89
4.1. Истинно молекулярное клонирование генов 89
4.1.1. Преимущества бесклеточного клонирования 89
4.1.2. Ген люциферазы: от светляка до индивидуальных молекулярных клонов 90
4.2. Экспрессия генов в молекулярных колониях 92
4.2.1. Новая разновидность генетического дисплея 92
4.2.2. Универсальный способ смены реакционной среды в геле 95
4.3. Перспективы развития метода клонирования генов вне клетки 96
4.3.1. Методы детекции молекулярных колоний 96
4.3.2. Изотермические системы размножения генов 98
4.3.3. Использование бесклеточной системы экспрессии, собранной из очищенных компонентов 99
Выводы 101
