Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Происхождение бобово-ризобиального симбиоза 13
1.2. Специфичность и механизм становления бобово-ризобиального симбиоза 14
1.3. Сигналлинг между ризобиями и бобовым растением 17
1.4. Лектины бобовых растений 26
1.4.1. Роль лектина в бобово-ризобиальном симбиозе 26
1.4.2. Структура и специфичность лектинов 35
1.5. Особенности организации генома клубеньковых бактерий 43
Глава 2. Объекты и методы исследований
2.1. Объекты исследований 47
2.2. Выделение и очистка ДНК растений 48
2.3. Выделение и очистка ДНК ризобий 49
2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК 49
2.5. Выделение и очистка одноцепочечной фагмидной ДНК... 51
2.6. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 52
2.7. Аналитический гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 53
2.8. Препаративный гель-электрофорез ДНК в неденатурирующих условиях 54
2.9. Элюция ДНК из агарозных гелей 54
2.10. Клонирование фрагментов генов лектина бобовых растений 55
2.11. Полимеразная цепная реакция 56
2.12. Подготовка компетентных клеток 57
2.13. Трансформация компетентных клеток Е.соН плазмиднои ДНК 58
2.14. Секвенирование ДНК ферментативным методом 58
2.15. Электрофоретическое фракционирование ДНК в денатурирующих условиях (секвенирующий гель-электрофорез) 60
2.16. Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 61
2.17. Бактериальные штаммы и фагмидные вектора 61
2.18. Экспрессия белка и его выделение 61
2.19 Электрофоретическое фракционирование белков в денатурирующих условиях 63
2.20. Реакции гемагглютинации 64
2.21. Реактивы и материалы 64
2.22. Составы использованных стандартных растворов 66
Глава 3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Анализ углеводсвязывающих участков лектинов бобовых растений 67
3.1.1. Клонирование и секвенирование фрагментов гена лектина бобовых растений 67
3.1.2. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов лектина козлятника восточного и лекарственного 69
3.1.3. Сравнительный анализ углеводсвязывающих аминокислотных последовательностей лектинов бобовых растений 78
3.1.4. Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей секвенированных фрагментов генов лектина клевера белого, лугового и волосистоголового 81
3.2. Создание гибридных белков лектина и анализ их углеводсвязывающих свойств 85
3.2.1. Создание гибридных конструкций гена лектина 87
3.2.2. Синтез лектинов в клетках E.coli и их выделение 91
3.2.3. Анализ специфичности лектинов 96
3.3. Анализ влияния природных и гибридных лектинов на взаимодействие бобовых растений с ризобиями 103
3.3.1 Экзогенная обработка лектинами бактерий в ризосфере бобовых растений 104
3.3.2 Влияние лектинов PSL, GOL и PSL/MAL на симбиоз Astragalus cicer и Galega oriental is с ризобиями 107
3.3.3 Влияние лектинов PSL, PSL/AGL на симбиоз Medicago sativa с ризобиями 109
Заключение 119
Выводы 122
Список литературы 124
