Введение
1. Введение 7
2. Обзор литературы
2.1 Общая характеристика метилирования ДНК 9
2.2 Геномный импринтинг и Х-инактивация 12
2.3 Абнормальное метилирование при канцерогенезе 22
2.4 Метил-ДНК-связывающие белки 24
2.5 Гены-мишени MBD-белков 29
2.6 Гистоновый код 31
2.7 Строение и возможные функции метил-ДНК-связывающего белка Каизо (Kaiso) 38
3. Материалы и методы
3.1 Работа с культурами эукариотических клеток 45
3.2 Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле 45
3.3 Метилирование ДНК-зондов для экспериментов по торможению ДНК-белковых комплексов в геле 46
3.4 Получение радиоактивно меченных ДНК-зондов для Саузерн- и Нозерн-блот анализа 46
3.5 Выделение ядерных экстрактов 47
3.6 Получение рекомбинантно-экспрессированных белков 47
3.7 Выделение тотальной ДНК из тканей 48
3.8 Выделение тотальной РНК из тканей 49
3.9 Полимеразная цепная реакция 49
3.10 Клонирование ПЦР-продукта в p-GEM-T вектор 50
3.11 Рестрикционный анализ 50
3.12 Трансформация E.coli и выделение плазмидной ДНК 51
3.13 Исследование ДНК-белкового взаимодействия методом торможения ДНК-белкового комплекса в геле 51
3.14 Иммунопреципитация хроматина 52
3.15 Обратная транскрипция 54
3.16 Бисульфитное секвенирование 54
3.17 Саузерн-блот анализ 55
3.18 Нозерн-блот анализ 56
3.19 ПНР в реальном времени 56
3.20 Количественный обсчёт результатов иммунопреципитации хроматина с последующей «ПНР в реальном времени» 57
3.21 Производство нокаута 57
3.22 Олигонуклеотиды 61
3.23 Компьютерный анализ 64
4 Результаты и их обсуждение
4.1 Метилзависимое взаимодействие Каизо с широким спектром последовательностей ДНК in vitro 65
4.2 Каизо взаимодействует с регуляторными областями «молчащих» генов ріб, IAP и генов, расположенных на неактивной Х-хромосоме, но не гена Матрилизин 68
4.3 Каизо взаимодействует с областью Н19 DMR in vitro 69
4.4 Каизо дифференциально взаимодействует с разными участками H19DMR 73
4.5 Определение профиля связывания Каизо в H19Agf2^0Kyce 73
4.6 Каизо взаимодействует с отцовским метилированным районом H19DMR 76
4.7 Делеция Каизо приводит к изменению структуры хроматина в районе Н19 DMR 77
4.8 Делеция Каизо не влияет на экспрессию генов HI9 и Igf2 81
4.9 Экспрессия IAP-элемента, а также генов Xist и Wntl 1 не зависит от взаимодействия Каизо с их регуляторными последовательностями 84
4.10 Делеция Каизо приводит к усилению экспрессии гена Tctexl 86
4.11 Каизо взаимодействует с геном Tctexl только на 17, но не на 6 хромосоме 88
4.12 Разница в экспрессии Tctexl не зависит от разницы в строении Т-комплекс содержащего локуса 91
4.13 Делеция Каизо не приводит к изменению метилирования ЦфГ-островка гена Tctexl 91
Заключение 95
