Введение
1. Обзор литературы 12
1.1.1. Распространение, локализация и физиологическая роль 12
1.1.2 Молекулярная масса, субъединичность, изоферменты 14
1.1.3. рН-оптимум и рН-стабильность 22
1.1.4. Температурный оптимум и термостабильность
1.1.5 Активаторы и ингибиторы 23
1.1.6 Механизм ферментативного действия щелочной фосфатазы
1.1.7. Субстратная специфичность 31
1.1.8. Первичная и пространственная структура щелочных фосфатаз 32
1.1.9 Генетическая регуляция 40
1.2 Использование различных тест-систем в экологическом мониторинге водных экосистем 40
2. Материалы и методы исследования 49
2.1 Реагенты и материалы, использованные в работе 49
2.2 Получение клеточных экстрактов беспозвоночных 50
2.3 Определение активности ЩФ в клеточных экстрактах беспозвоночных 51
2.4 Определение влияния ДТТ и морской воды на активность ЩФ из беспозвоночных 51
2.5 Выделение гомогенного препарата StЩФ 52
2.6 Определение активности StЩФ 53
2.7 Определение рН-оптимума и рН-стабильности StЩФ 53
2.8 Определение температурного оптимума и температурной стабильности StЩФ з
2.9 Определение влияния различных реагентов на активность StЩФ 54
2.10 Определение молекулярной массы StЩФ мтодом денатурирующего электрофореза 55
2.11 Определение субстратной специфичности StЩФ 55
2.12 Определение кинетических параметров StЩФ 55
2.13 Статистика 55
2.14 Исследование вторичной и третичной структуры StЩФ методами оптической спектроскопии 56
2.15 Трипсинолиз StЩФ в ПААГ с Na-ДДС 57
2.16 MALDI TOFOF масс-спектрометрия 57
2.17 Фосфатазная тест-система 2.17.1 Получение клеточного экстракта 58
2.17.2 Определение активности эStЩФ 58
2.17.3 Влияние химических реагентов на активность ЩФ (модельные эксперименты с прединкубацией) 59
2.17.4 Тестирование природных морских вод с помощью различных тест-систем 60
2.17.5 Тестирование проб пресной воды с помощью фосфатазной тест-системы 62
2.17.6 Иммобилизация эStЩФ яйцеклеток морского ежа 62
3 Результаты и их обсуждение 64
3.1 Поиск щелочных фосфатаз среди морских беспозвоночных 64
3.2 Выделение и характеристика свойств StЩФ
3.2.1 Молекулярные формы StЩФ 78
3.2.2 Выделение и очистка StЩФ. 80
3.2.3 рН-оптимум и рН-стабильность фермента 82
3.2.4 Температурный оптимум и температурная стабильность 83
3.2.5 Влияние одновалентных ионов на активность StЩФ 84
3.2.6 Влияние ионов двухвалентных металлов на активность StЩФ 86
3.2.7 Влияние дитиотреитола на StЩФ 88
3.2.8 Влияние различных ингибиторов на активность StЩФ 89
3.2.9 Определение молекулярной массы StЩФ 91
3.2.10 Субстратная специфичность StЩФ 92
3.2.11. Пространственная структура StЩФ 94
3.2.12 Трипсинолиз StЩФ и масс-спектрометрия полученных пептидов (пептидный масс фингерпринт). 97
3.3 Разработка фосфатазной тест-системы 98
3.3.1 Фосфатазная тест-система (модельные эксперименты в морской и пресной воде) 98
3.3.2 Сравнение чувствительности фосфатазной, ДНКазной тест-систем и ОСС-теста к различным реагентам в морской воде (модельные эксперименты) 103
3.3.3 Оценка суммарного загрязнения природных морских и пресных вод.. 107
3.3.4 Фосфатазная тест-система (иммобилизация фермента в гели) 114
Выводы 117
Список литературы
