Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 9
1.1. Ферменты, содержащиеся в поджелудочной железе животных и методы их выделения 9
1.1.1. Рибонуклеаза (РНКаза) 10
1.1.1.1. Получение рибонуклеазы (РНКазы) 17
1.1.2. Дезоксирибонуклеаза (ДНКаза) 19
1.1.2.1. Получение дезоксирибонуклеазы (ДНКазы). 21
1.1.3. Фермент холестеролэстераза 24
1.1.3.1. Получение холестеролэстеразы 25
1.1.4. Фермент трипсин 26
1.1.4.1. Получение трипсина 29
1.2. Использование ферментов нуклеазного действия для получения рибо- и дезоксирибонуклеозид-З-монофосфатов и биосинтез их полифосфато 30
1.2.1 .Перспективные микробные нуклеазы 30
1.2.1.1. Перспективный фермент нуклеазного действия - S-нуклеаза и технология его выделения 33
1.2.2. Синтез рибо- и дезоксирибонуклеозид-5- трифосфатов .34
1.2.3. Иммобилизация ферментов 38
1.2.4. Методы модификации сорбентов 41
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 47
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение 50
3.1. Разработка методов получения РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы из поджелудочной железы крупного рогатого скота 50
3.1.1. Получение "грубых" экстрактов ферментов: РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы 50
3.1.2. Фракционирование ферментов экстракта поджелудочной железы сульфатом аммония... 54
3.1.2.1. Выделение и анализ холестеролэстеразы 59
3.1.2.2. Выделение и анализ трипсина 60
3.1.2.3. Выделение и анализ ДНКазы 60
3.1.2.4. Получение РНКазы высокой очистки 64
3.1.2.5. Получение субстрата (РНК) для анализа активности фермента рибонуклеазы 73
3.1.2.6. Эффективность предлагаемого метода получения ферментов РНКазы, ДНК-азы, трипсина и холестеролэстеразы из поджелудочной железы крупного рогатого скота 75
3.2. Новые подходы к синтезу дезоксирибо- и рибонуклеозид-5;-монофосфатов и их трифосфатов 77
3.2.1. Получение субстрата ДНК для получения нуклеотидов .77
3.2.2. Выделение В-нуклеазы из микробиологической субстанции —амилоризина 77
3.2.3 ИммобилизацияЗ-нуклеазы 79
3.2.3.1. Адсорбционная иммобилизация З^нуклеазы на углерод минеральных неорганических носителях 79
3.2.3.2, Исследование ковалентной иммобилизации З-нуклеазы на силикатных носителях 80
3.2.4. Гидролиз нуклеиновых кислот ферментом S-нуклеазой 82
3.2.5. Получение и анализ ацетилфосфата лития 84
3.2.6. Ферментативное фосфорилирование индивидуальных NMP 84
3.2.7. Получение dNTP и NTP сопряжённым фосфорилированием продуктов гидролиза РНК и ДНК 86
ГЛАВА 4. Экспериментальная часть 89
4.1. Получение ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы 89
4.1.1. Получение субстрата (РНК) для анализа активности фермента рибонуклеазы 89
4.1.2. Очистка ферментов РНКазы, ДНКазы, трипсина и холестеролэстеразы 90
4.1.3. Электрофоретический анализ чистоты ДНКазы и РНКазы 96
4.1.4. Определение удельной активности ферментов 96
4.1.5. Стерилизация, розлив и лиофильная сушка 100
4.2. Новые подходы к синтезу дезоксирибо- и рибонуклеозид-5-монофосфатов и их трифосфатов 101
4.2.1. Получение субстрата (ДНК) для ферментов ДНКазы и S1- нуклеазы 101
4.2.2. Выделение ферментного препарата в^нуклеазы из амилоризина 101
4.2.3. Определение активности S -нуклеазы 102
4.2.4. Иммобилизация Б-нуклеазы 104
4.2.5. Гидролиз ДНК ферментом Б-нуклеазой 105
4.2.6. Гидролиз РНК В^нуклеазой в растворе 107
4.2.7. Гидролиз РНК иммобилизованной S-нуклеазой 107
4.2.8. Последовательный гидролиз ДНК ферментами ДНК-азой и иммобилизованной S-нуклеазой 107
4.2.9. Последовательный гидролиз ДНК ферментами ДНКазой и не иммобилизованной З нуклеазой 108
4.2.10. Получение и анализ ацетилфосфата лития 109
4.2.11. Выделение суммарного препарата нуклеотидилкиназ с ацетокиназой 109
4.2.12. Ферментативное фосфорилирование индивидуальных NMP 110
4.2.13. Ферментативное фосфорилирование NMP и dNMP в смеси 112
Заключение 113
Выводы 116
Список литературы 117
Благодарности 130
