Введение
Глава 1. Общая характеристика аэробных метилотрофных бактерий 8
1.1. Таксономическое разнообразие аэробных метанотрофов 8
1.2. Пути окисления Q - соединений у метилотрофных бактерий 9
1.3. Система транспорта электронов и окислительное фосфорилирование 13
1.4. Пути ассимиляции С]-соединений . 14
1.5. Центральный метаболизм 20
Глава 2. Энзимологические аспекты метаболизма неорганического пирофосфата 21
2.1. Пути образования и локализация ФФ в клетках 21
2.2. Пирофосфатзависимые ферменты микроорганизмов 24
2.3. Характеристика и метаболическая роль неорганических пирофосфатаз 25
2.4. Свойства и метаболическая роль ПФК 27
2.5. Филогенетический анализ и эволюция ПФК 35
Глава 3. Объекты и методы исследования 41
3.1. Объекты исследований 41
3.2. Культивирование бактерий 41
3.3. Методы разрушения клеток и получения бесклеточных экстрактов 42
3.4. Измерение активности ферментов 43
3.5. Очистка ПФК из М. methanica 12 47
3.6. Очистка пирофосфатазы из Mmethamca 12 47
3.7. Электрофоретические методы. 49
3.8. Иммуноцитохимическое выявление ПФК в клетках M.methanica 12 50
3.9. Гель-хроматография 51
3.10. Определение кинетических параметров ПФКиФФ,газы 52
3.11. Включение3 Р-ортофосфатав ФФ„ и Фр-1,6-Ф2 в реакции ПФК in vitro 52
3.12. Молекулярно-биологические методы 54
3.12.1. Манипуляции с хромосомной ДНК М. methanica 12 54
3.12.2. Методы с использовашем ПЦР 55
3.12.3. Выделение плазмид из рекомбинантных клонов 57
3.12.4. Секвенирование ПЦР - продуктов 58
3.12.5. Филогенетический анализ генов ПФК и АТФ-ФФК 58
3.12.6. Клонирование, экспрессия и очистка рекомбинантной ПФК 58
3.13. Аналитические методы 60
Глава 4. Результаты и обсуждение. 63
4.1. Распространение ПФК у аэробных метилотрофных бактерий 63
4.2. Влияние условий культивирования М. methanica на активность ПФК и ФФ,газы 66
4.3. Вігутриклеточная локализация ФФн-зависимых ферментов M.methanica 12 74
4.4. ОчисткаихарактериегикаПФКЛ/те//гашсй12 81
4.5. Очистка и характеристика неорганической пирофосфатазы М. methanica 12 90
4.6. Секвенирование гена ПФК М. methanica 12 , 97
4.7. Клонирование и экспрессия гена ПФК М. methanica 12 102
4.8. Метод биосинтеза ФФН, меченного фосфором Р 103
Заключение , 109
Выводы 114
Список литературы 115
