Введение
Обзор литературы 11
1. Общая характеристика рода Potexvirus 11
1.1 Структура генома 11
1.2 Вирусные белки, кодируемые геномом потексвирусов 31
2. Вирус мозаики альтернантеры 40
2.1 Структура генома ВМАльт 43
2.2 Белки, кодируемые геномом ВМАльт 44
3. Создание векторов на основе геномов представителей рода Potexvirus 50
3.1 Полноразмерные вирусные векторы, полученные на основе генома ХВК 52
3.2 Деконструированные вирусные векторы на основе генома ХВК 58
3.3 Векторы на основе генома вируса мозаики альтернантеры (ВМАльт) 61
Материалы и методы 64
1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 65
2. Подбор праймеров для ПЦР 66
3. Рестрикция ДНК 69
4. Лигирование фрагментов ДНК 69
5. Трансформация бактериальных клеток 69
6. Выделение плазмидной ДНК 70
7. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в агарозном геле 71
8. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля 71
9. Выделение тотальной РНК из листьев растений Nicotiana benthamiana 10. Получение кДНК-копий субгеномных РНК, образуемых векторами 72
11. Получение кДНК-копии фрагмента кодирующей последо-вательности гемагглютинина вируса гриппа А 73
12. Получение бинарного вектора p(AltMV-single) 74
13. Получение бинарного вектора p(AltMV-double) 78
14. Получение бинарного вектора p(AltMVriple) 79
15. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double ) 80
16. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-MCS) 80
17. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-GFP) 81
18. Схема получения вектора pQE-HARBD 82
19. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-HARBD) 83
20. Схема получения бинарного вектора p(AltMV-double-hGCSF) 83
21. Схема получения вектора pQE-hGCSF 84
22. Электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле 85
23. Вестерн-блот 85
24. Агроинфильтрация листьев Nicotiana benthamiana 86
25. Анализ накопления целевых белков в листьях N. benthamiana 87
26. Получение вирусоподобных частиц из БО вируса мозаики альтернантеры, экспрессированного вирусными векторами в листьях N. benthamiana 87
27. Выделение целевых белков из листьев растения N. benthamiana 88
28. Экспрессия и выделение рекомбинантных белков из клеток E. coli. 88
29. Электронная микроскопия: 89
Результаты и обсуждение 90
1. Создание векторов с одним и двумя последовательно расположенными субгеномными промоторами, контролирующими экспрессию гена целевого белка 91
2. Исследование транскрипционной активности субгеномных промоторов в составе вектора AltMV-double 97
3. Исследование вирусоподобных частиц, образующихся из БО ВМАльт при экспрессии вектора AltMV-double в листьях N. benthamiana 102
4. Экспрессия целевых белков различной природы в растениях N. benthamiana с помощью вектора AltMV-double 106 5. Изучение влияния введения дополнительного третьего СГП на эффективность вектора AltMV-double 116
Заключение 121
Выводы 124
Список литературы 125
