Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Роль экзосом в процессе канцерогенеза .11
1.1.1. Общая характеристика эукариотических микропузырьков .11
1.1.2. Роль экзосом в процессах опухолевой прогрессии и метастазирования 13
1.1.3. Подавление систем наследственного и приобретенного иммунитета 18
1.1.4. Активация процессов васкуляризации и ангиогенеза .19
1.1.5. Анализ протеома опухолевых экзосом 21
1.2. Методы иммуноанализа белков 24
1.2.1. Общий обзор 24
1.2.2. Радиоиммуноанализ (РИА) 29
1.2.3. Иммуно-ферментный анализ (ИФА) 30
1.2.4. Иммуно-ПЦР .33
1.2.5. Электрохимический анализ 37
1.2.6. Коиммунопреципитация хроматина (ChIP) .38
Глава 2. Материалы и методы исследования 41
2.1. Антисыворотки .41
2.2. Коммерческие антитела и их конъюгаты .42
2.3. Коллекция образцов 42
2.4. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом и микровезикул .43
2.5. Экстракция белков 44
2.6. Электрофорез белков в ПААГ 44
2.6.1. Трис-глициновая система 44
2.6.2. Трис-трициновая система 44
2.7. Окрашивание гелей 45
2.7.1.Окрашивание гелей Кумасси 45
2.7.2.Окрашивание гелей солями серебра .45
2.8. Вестерн-блот анализ 46
2.9. Дот-блот анализ .46
2.10. Разделение продуктов ПЦР 47
2.11. Выделение сывороточных экзосом 47
2.11.1. Выделение экзосом ультрацентрифугированием 47
2.11.2.Выделение экзосом с использованием препарата Exoquick .47
2.12. Иммунопреципитация 48
2.12.1.Иммунопреципитация дефензина 5 из образцов сыворотки крови 48
2.12.2.Иммунопреципитация экзосом из образцов сыворотки крови 48
2.13. Получение рекомбинантных фрагментов белков 48
2.14. Масс-спектрометрический анализ .49
2.15. Получение моноклональных антител .50
2.16. Очистка моноклональных антител 51
2.17. Получение высокоаффинных поликлональных антител .52
2.18. Очистка поликлональных антител 52
2.19. Иммуно-ПЦР 53
2.19.1. Синтез праймеров 53
2.19.2.Конъюгация антител и ДНК-репортера JW с магнитными микрошариками 54
2.19.3. Иммуно-ПЦР в прямом формате .54
2.19.4. Иммуно-ПЦР в сэндвич формате .55
Глава 3. Результаты и обсуждение 57
3.1. Сбор коллекции образцов 57
3.2. Биоинформатический поиск мембранных белков эпителия толстой кишки, секретируемых в кровоток в составе опухолевых экзосом .57
3.3. Получение рекомбинантных фрагментов отобранных белков .61
3.4. Получение высокоаффинных поликлональных антител к фрагментам рекомбинантных белков 64
3.5. Получение моноклональных антител .70
3.6. Разработка нового формата иммуно-ПЦР для обнаружения рака толстой кишки 72
3.6.1. Очистка экзосом из образцов сыворотки крови 72
3.6.2. Обнаружение рака толстой кишки на основе анализа белков опухолевых экзосом сыворотки крови .75
3.6.2.1.Синтез бинарного конъюгата детектирующих антител и ДНК-репортера с магнитными микрошариками 78
3.6.2.2. Амплификация ДНК-репортера .78
3.6.2.3.Оценка чувствительности протокола в модельном эксперименте .79
3.6.2.4. Иммуно-ПЦР сывороточных экзосом 80
Выводы 84
Список литературы .85
