Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Этапы развития цитогенетики человека 11
1.2. Хромосомные аберрации 12
1.2.1. Численные хромосомные аберрации 13
1.2.2. Структурные хромосомные аберрации 14
1.3. Методы цитогенетического анализа 21
1. 3.1. Методы дифференциального окрашивания хромосом 21
1.3.2. Метод in situ гибридизации нуклеиновых кислот 26
1.3.2.1. ДНК-пробы, используемые в гибридизации in situ 27
1.3.2.2. Супрессионная гибридизация in situ и обратный пэйнтинг 28
1.3.2.3. Интерфазный FISH-анал из 29
1.3.2.4. Многоцветная in situ гибридизация 30
1.3.2.4.1. M-FISH 31
1.3.2.4.2. Спектральное кариотипирование (SKY- Spectral Karyotyping) 31
1.3.2.4.3. RxFISH 32
1.3.2.4.4. Многоцветный бэндинг индивидуальных хромосом (МСВ -Multi Color Banding) 33
1.3.2.5. Сравнительная геномная гибридизация 34
1.3.2.6. Методы идентификации маркерных хромосом 35
1.3.2.6.1. AcroM-FISH 35
1.3.2.6.2. SubcenM-FISH 36
1.3.2.6.3. CenM-FISH 37
1.3.2.7. Методы пренатальной цитогенетической диагностики 38
1.4. Сравнение возможностей использования различных методов цитогенетического анализа для целей диагностики хромосомной патологии человека 40
Глава 2. Материал и методы 41
2.1. Получение препаратов метафазных хромосом 42
2.1.1. Культивирование лейкоцитов периферической крови 42
2.1.2. Фиксация митотических клеток 42
2.1.3. Приготовление препаратов метафазных хромосом для GTG-окрашивания .43
2.1.4. Приготовление препаратов метафазных хромосом для FISH 43
2.1.5. Приготовление препаратов метафазных хромосом для микродиссекции 44
2.2. GTG-дифференциальное окрашивание метафазных хромосом 44
2.3.Микродиссекция метафазных хромосом 44
2.3.1. Подготовка микропипеток и игл для микродиссекции 44
2.3.2. Проведение микродиссекции хромосом 44
2.4. Полимеразная цепная реакция с частично вырожденным праймером (degenerate oligonucleotide primer polymerase chain reaction - DOP-PCR) 45
2.5. Мечение ДНК микродиссекционных ДНК - библиотек 46
2.6. Получение Cot-2 ДНК из плаценты человека 46
2.7. Супрессионная in situ гибридизация 47
2.8. Детекция на цитологических препаратах меченых ДНК-проб 48
2.8.1. Детекция на цитологических препаратах биотин-16-дУТФ меченых ДНК-проб 48
2.8.2. Выявление ДНК-проб, меченых дигоксигенин-11-дУТФ 49
2.9. Создание ДНК*пробы, специфичной теломерным повторам всех хромосом человека методом ПЦР 49
2.10. Получение ДНК-пробы, специфичной ядрышкообразующим районам всех хромосом человека 50
2.11. Получение ДНК-пробы, гомологичной Alu повтору, с помощью ПЦР 50
2.12. Получение ДНК-проб, специфичных эухроматиновому материалу хромосом, методом Inter-Alu ПЦР 51
2.13. Одновременное выявление двух гаптен-меченых ДНК-проб 52
2.14. Многоцветный бэндинг хромосом 52
2.15. Микроскопический анализ препаратов метафазных хромосом 52
Глава 3. Результаты и обсуждение 53
3.1. Первичный цитогенетический анализ хромосомных аномалий 53
3.2. Анализ маркерных хромосом с помощью молекулярно-цитогенетических методов 72
3.2.1. Анализ организации маркерных хромосом (MX) микродиссекцией и in situ гибридизацией ДНК-проб, специфичных MX, а также in situ гибридизацией с ДНК-пробами, специфичными теломерным повторам и рибосомальной ДНК 73
3.2.2. Детекция эухроматиновых районов хромосом человека 79
3.2.2Л. ДНК-пробы для выявления эухроматиновых районов 80
3.2.2.2. Распределение Alu и LINE1 повторенных последовательностей ДНК в хромосомах человека 83
3.2.2.3. ДНК-пробы, основанные на повторенных диспергированных последовательностях 84
3.2.2.4. FISH с метафазными хромосомами человека меченного Alu повтора и продукта Inter-Alu-PCR 85
3.2.2.5. FISH IAP- и Alu-ДНК-проб с MX человека 86
3.3. Анализ делеций с помощью методов микродиссекции и обратного пэйнтинга. 90
3.4. Анализ транслокаций молекулярно-цитогенетическими методами 93
3.4.1. Анализ хромосомных транслокаций с помощью гибридизации с хромосомоспецифичными зондами 93
3.4.2. Анализ хромосомных транслокаций методами микродиссекции и обратного пэйнтинга 95
3.5. Анализ инверсии хромосомы 7 с помощью многоцветного бэндинга 106
Глава 4. Заключение 108
Выводы 111
Список литературы 113
