Введение
I. Обзор литературы
1. Иммунтерапевтические подходы к лечению злокачественных новообразований 10
1.1. Пассивная иммунотерапия 11
1.2. Активная иммунотерапия и противоопухолевые вакцины 12
1.3. Противоопухолевые вакцины: проблемы и перспективы 16
2. Белки теплового шока 70кДа и их внутриклеточные функции 20
2.1. Молекулярная структура белков семейства HSP70 20
2.2. Номенклатура генов белков семейства HSP70 21
2.3. Функции HSP70 внутри клетки 23
2.4. Механизм связывания пептидов с HSP70 27
3. Внеклеточные функции HSP70 29
3.1. Механизмы выхода HSP70 из клеток 29
3.2. Иммунологические функции HSP70 30
3.3. Стратегии создания вакцин на основе HSP70 32
II. Экспериментальная часть
Материалы 36
Методы исследования 38
1. Получение мРНК и кДНК генов семейства HSP70 человека 38
2. Конструирование экспрессионных векторов 38
2.1. Амплификация ДНК 3 8
2.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле и экстракция фрагментов ДНК из легкоплавкой агарозы 39
2.3. Рестрикция плазмид 40
2.3.1. Рестрикция плазмиды pUC19 Smal рестриктазой
2.3.2. Рестрикция плазмид pUC19-HSP70 I, pUC19- HSP70 II, pUC19-HSC70 I и pUC 19- HSC70 II рестриктазами PstI и Hindlll
2.3.3. Рестрикция плазмиды pQE80L рестриктазами BamHI и Hindlll
2.3.4. Рестрикция плазмид pUC19-HSP70AiB. pUC19-HSP70HYB, pUC19-HSC70 и PUC19-HSC70HYB рестриктазами BamHI и Hindlll
2.4. Дефосфорилирование рестриктированной Smal плазмиды pUC19 40
2.5. Фосфорилирование фрагментов ДНК 41
2.6. Лигирование 41
2.7. Получение компетентных клеток и их трансформация 41
2.8. Выделение плазмид методом щелочного лизиса 42
3. Наращивание клеточной биомассы штамма-продуцента E.coli и индукция синтеза рекомбинантных белков 42
4. Выделение рекомбинантных белков из биомассы штаммов-продуцентов E.coli 43
5. Определение спектральных характеристик белков 43
5.1. Измерение спектральных характеристик белков при различных значениях рН среды 43
5.2. Измерение спектральных характеристик белков при взаимодействии с пептидами 44
6. Определение АТРазной активности рекомбинантных белков 44
7. Получение комплексов рекомбинантных белков HSP70 с синтетическими пептидами 44
7.1. Получение меченых FITC синтетических пептидов 44
7.2. Получение комплексов индивидуальных пептидов с HSP70 44
7.3. Получение комплексов смеси меченого и немеченого пептидов с HSP70HYB 45
7.4. Получение комплексов смеси немеченых пептидов с HSC70 45
8. Определение кинетических характеристик HSP70 46
9. Получение комплексов рекомбинантных белков с пептидной фракцией лизата опухолевых клеток 46
9.1. Получение пептидной фракции лизата опухолевых клеток 46
9.2. Получение комплексов пептидной фракции лизата опухолевых клеток с HSP70 47
10. Анализ клеточных пептидов, образующих комплексы с HSP70 47
11. Анализ индукции цитотоксической активности Т лимфоцитов 48 11.1. Культивирование клеток 4 8
11.2. Получение дендритных клеток 48
11.3. Анализ фенотипа ДК 49
11.4. Нагрузка ДК опухолеспецифическими антигенами 49
11.5. Индукция специфических цитотоксических лимфоцитов 49
11.6. Определение цитотоксической активности ЦТЛ 50
III. Результаты и обсуждение
1. Клонирование генов семейства HSP70 в экспрессионных плазмидных векторах 52
2. Получение рекомбинантных белков 55
3. Исследование спектральных характеристик рекомбинантных HSP70 57
4. Исследование динамики связывания рекомбинантных HSP70 с пептидами 65
5. Исследование АТР-азной активности HSP70 72
6. Исследование влияния различных параметров на связывание HSP70
с пептидами 75
7. Исследование взаимодействия HSP70 со смесью пептидов 77
8. Исследование взаимодействия HSP70 с пептидной фракцией лизата опухолевых клеток 80
9. Исследование цитотоксической активности 86
Заключение 88
Выводы 91
Список литературы
