Введение
ГЛАВА 1. Современные подходы к лечению онкологических заболеваний (обзор литературы) 12
1.1 Противоопухолевые препараты на основе ген-направленных нуклеиновых кислот 13
1.1.1 Механизмы действия противоопухолевых препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот 13
1.1.1.1 Механизм действия антисмысловых олигонуклеотидов 13
1.1.1.2 Механизм действия малых интерферирующих РНК (siPHK) 16
1.1.1.3 Механизм действия рибозимов 17
1.1.1.4 Механизм действия "10-23" ДНКазимов 18
1.1.2 Гены-мишени для лекарственных препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот 18
1.1.3 Применение препаратов на основе ген-направленных нуклеиновых кислот в культуре клеток, в экспериментальных моделях животных и в клинической практике 29
1.1.3.1 Ras 29
1.1.3.2 C-myc ЗО
1.1.3.3 РКС-а 32
1.1.3.4 Кластерин 32
1.1.3.5 Bcl-2 33
1.1.3.6 RaM 34
1.1.3.7 DNMT1 35
1.1.3.8 RRR2 35
1.1.3.9 VEGF 36
1.1.3.10 neu/HER-2 (ErbB-2) 37
1.1.3.11 Другие гены-мишени 38
1.2 Ферментативные противоопухолевые препараты на основе рибонуклеаз 50
1.2.1 Возможные механизмы цитотоксического действия РНКаз 51
1.2.2 Применение BS-РНКазы для терапии опухолей 55
1.2.3 Применение онконазы для терапии злокачественных заболеваний в эксперименте и в клинике 57
1.2.4 Химически модифицированные РНКазы 59
1.2.5 Мутантные РНКазы 59
1.2.6 Химерные РНКазы 60
1.2.7 Тандемные РНКазы 61
1.3 Активация лекарственного средства через трансдукцию опухолевых клеток генами-самоубийцами 62
1.4 Восстановление функции генов-супрессоров опухоли 68
1.5 Иммуногенная терапия 73
1.6 Заключение 76
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 78
2.1 Материалы 78
2.1.1 Реактивы и препараты 78
2.1.2 Оборудование 78
2.1.3. Плазмиды 79
2.1.4 Олигонуклеотиды 79
2.1.5 Буферы и растворы, использованные в работе 80
2.1.6 Лабораторные животные и опухолевые модели 81
2.2 Методы 81
2.2.1 Гель-электрофорез 81
2.2.1.1 Электрофорез в агарозном геле 81
2.2.1.2 Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях 82
2.2.1.3 Электрофорез в ПААГ в нативных условиях 82
2.2.2 Получение первичных культур опухолевых клеток из асцитной жидкости 82
2.2.3 Выделение суммарной клеточной РНК 82
2.2.4 Определение уровня экспрессии генов в опухолевых клетках методом ОТ-ПЦР
83
2.2.4.1 Обратная транскрипция 83
2.2.4.2 ПЦР 83
2.2.5 Приготовление дуплексов siPHK 84
2.2.6 Трансфекция клеток siPHK in vitro 84
2.2.7 Трансфекция клеток siPHK ex vivo 85
2.2.8 Определение чувствительности клеток к действию цитостатиков (МТТ тест) .85
2.2.9 Определение чувствительности опухолей LS, RLS и RLS40 к химиопрепаратам in vivo 86
2.2.10 Исследование терапевтического потенциала терапии, включающей трансфекцию опухолевых клеток siPHK ex vivo и in vivo и лечение цитостатиками...86
2.2.10.1 Ex vivo 86
2.2.10.2 In vivo 87
2.2.11 Введение радиоизотопной метки в состав РНК и ДНК с использованием полинуклеотидкиназы 87
2.2.12 Исследование активности РНКазы A in vitro 88
2.2.13 Исследование активности ДНКазы I in vitro 88
2.2.14 Инактивация РНКазы А 88
2.2.15 Исследование каталитической активности РНКазы А после её инактивации 88
2.2.16 Инактивация ДНКазы I 89
2.2.17 Исследование каталитической активности ДНКазы I после её инактивации...89
2.2.18 Определение концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот в плазме крови 89
2.2.18.1 Получение образцов плазмы крови у мышей 89
2.2.18.2 Выделение внеклеточных нуклеиновых кислот и определение их концентрации в плазме крови 90
2.2.18.3 Определение суммарной ДНКазной и РНКазной активности плазмы крови 90
2.2.19 Исследование противоопухолевой и антиметастатической активности РНКазы
А и ДНКазы I in vivo 91
2.2.19.1 Исследование онкосупрессивного действия РНКазы А на модели LLC с применением широкого диапазона доз фермента 91
2.2.19.2 Исследование онкосупрессивного действия РНКазы А и ДНКазы I на моделях LLC и НА-1 91
2.2.19.3 Исследование антиметастатического действия смеси РНКазы А и ДНКазы I на модели LLC 92
2.2.19.4 Исследование онкосупрессивного действия инактивированных ферментов РНКазы А и ДНКазы I на модели LLC 92
2.2.20 Гистология 92
2.2.21 Статистический анализ 93
ГЛАВА 3. Исследование противоопухолевой и антиметастатической активности SIPHK, рнказы а и днказы i - препаратов, способных специфически и неспецифически вызывать деградацию нуклеиновых кислот (результаты и обсуждение) 94
3.1 Противоопухолевый потенциал siPHK в комбинации с химиотерапией 94
3.1.1 Описание субштаммов лимфосарком LS и RLS 94
3.1.2 Сравнение профиля экспрессии генов, вовлечённых в формирование синдрома МЛУ, в клетках опухолей LS и RLS и их чувствительности к цитостатикам 95
3.1.3 Определение уровня экспрессии генов в клетках опухолей LS и RLS 97
3.1.4 Селекция высокорезистентной клеточной линии RLS40 98
3.1.5 Оценка чувствительности клеточных линий RLS5, RLS10, RLS2o и RLS4o к цитостатикам 100
3.1.6 Определение уровня экспрессии генов mdrla, mdrlb, bcl-2 и р53 в клетках линии RLS4o 101
3.1.7 Исследование способности клеток линии RLS40 формировать опухоль in v/Vo101
3.1.8 Сравнение чувствительности опухолей LS, RLS и RLS4o к цитостатикам in vivo 102
3.1.9 Обращение фенотипа МЛУ клеток линии RLS40 под действием siPHK/n wfro.103
3.1.10 Исследование влияния siPHK на уровень мРНК генов mdrla, mdrlb и bcl-2 в клетках линии RLS40 103
3.1.11 Восстановление чувствительности клеток линии RLS40 к винбластину под действием mdrlb siPHK 105
3.1.12 Обращение фенотипа МЛУ опухоли RLS40 под действием siPHK ex vivo 106
3.1.13 Обращение фенотипа МЛУ под действием siPHK/л vivo 110
3.1.14 Заключение 111
3.2 Исследование противоопухолевого и антиметастатического потенциала РНКазы
АиДНКазы! 111
3.2.1 Выбор и описание моделей опухолевой прогрессии 112
3.2.2 Выбор диапазона доз РНКазы А и ДНКазы I для экспериментов in vivo 112
3.2.3 Исследование влияния РНКазы А на рост первичной опухоли LLC 113
3.2.4 Исследование влияния ДНКазы I на рост первичной опухоли LLC 116
3.2.5 Исследование влияния РНКазы А и ДНКазы I на развитие метастазов 116
3.2.6 Гистологическое исследование метастазов у мышей контрольных групп 117
3.2.7 Гистологическое исследование метастазов в группах мышей, получавших лечение РНКазой А и ДНКазой 1 119
3.2.8 Влияние РНКазы А и ДНКазы I на площадь, занимаемую метастазами, в лёгких у мышей с LLC и печени у мышей с НА-1 120
3.2.9 Анализ корреляции между каталитической функцией РНКазы А и ДНКазы I и их противоопухолевой и антиметастатической активностями 123
3.2.9.1 Определение концентрации внеклеточных нуклеиновых кислот и суммарной рибо/дезоксирибонуклеазной активности в плазме крови мышей, получавших лечение РНКазой А и ДНКазой 1 123
3.2.9.2 Определение концентрации внДНК и суммарной ДНКазной активности в плазме крови мышей с LLC и НА-1 до и после лечения ДНКазой 1 124
3.2.9.3 Определение концентрации внеклеточных РНК и суммарной РНКазной активности в плазме крови мышей с LLC и НА-1 до и после лечения РНКазой А 125
3.2.9.4 Исследование влияния ферментов РНКазы А и ДНКазы I с инактивированной каталитической функцией на развитие первичной опухоли и метастазирование 126
3.2.10 Заключение 128
Выводы 132
Список литературы 134
