Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 11
1.1 Опухолевый супрессор ARF и его значение в канцерогенезе 11
1.1.1 Строение и биологическая значимость локуса INK4a/ARF 11
1.1.2 Cтруктурная организация и биохимические особенности белка ARF 12
1.1.3 Механизмы регуляции экспрессии локуса INK4a/ARF в опухолях человека 14
1.1.5 p53 - зависимые и p53 - независимые функции опухолевого супрессора ARF 19
1.2.1 Типы и механизмы аутофагии 25
1.2.2 Роль аутофагии в поддержании клеточного гомеостаза 29
1.2.5 Роль cелективной и неселективной аутофагии в канцерогенезе 38
ГЛАВА II. Методы исследования 47
2.1 Культивирование клеток 47
2.3 Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле 50
2.4 Трансформация компетентных клеток E. Сoli 51
2.5 Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток 52
2.6 Стабильная трансфекция клеток млекопитающих плазмидной ДНК 53
2.7 Иммуноблоттинг 54
2.8 Метод сайт-направленного мутагенеза 55
2.9 Иммуноцитофлюоресцентный анализ 56
2.10 Флоуцитометрический анализ мембранного потенциала митохондрий (Guava MitoPotential Assay) 57
2.11 Трансмиссионная электронная микроскопия 58
2.12 ПЦР в реальном времени 58
2.13 Инфицирование клеток ретровирусами 59
2.14 Выделение митохондрий 60
2.15 Методы статистического анализа 60
ГЛАВА III. Результаты исследований и их обсуждение 62
3.1 Определение участка митохондриальной локализации опухолевого супрессора p19ARF 62
3.2 Выявление участка белка p19/ARF, отвечающего за активацию неселективной аутофагии 68
3.3 Исследование роли C-концевого участка p14ARF в активации неселективной аутофагии в клетках человека 72
3.4 Влияние точеченых мутаций гена Ink4a/ARF, индуцируемых в опухолевых клетках человека, на ARF – опосредованную аутофагию 78
3.5 Изучение роли укороченной формы белка ARF – smARF в процессе митофагии 81
3.6 Оценка взаимного влияния экспрессии pARF и p53 на регулируемую ими аутофагию в клетке 90
Заключение 94
Выводы 101
Список литературы
