Введение
1. Обзор литературы 12
1.1. Оогенез у мыши 12
1.2. Ядрышко – основной структурный домен клеточного ядра эукариот 17
1.2.1. Ядрышки соматических клеток 17
1.2.2. Основные белки ядрышек 20
1.2.3. Производные ядрышка в митозе и мейозе 22
1.3. Ядрышко-подобное тельце – производное ядрышка в предовуляторных ооцитах 23
1.3.1. Изменение морфологии ядрышек во время роста ооцита 23
1.3.2. ЯПТ предовуляторных ооцитов 25
1.3.3. Ультраструктурная организация ЯПТ ооцитов NSN- и SN-типов 27
1.3.4. Результаты исследований состава ЯПТ 29
1.3.5. Современные представления о функциях ЯПТ 33
1.4. Заключение 36
2. Материалы и методы 37
2.1. Материалы 37
2.1.1. Лабораторное оборудование 37
2.1.2. Реактивы 38
2.1.3. Антитела 39
2.1.4. Культура клеток 41
2.1.5. Лабораторные животные 41
2.2. Методы 41
2.2.1. Окрашивание фибробластов NIH/3Т3 РНК-связывающими красителями акридиновым оранжевым и пиронином Y.
2.2.2. Окрашивание внутриклеточных белков с помощью ФИТЦ 42
2.2.3. Иммуноцитохимическое выявление белков в клетках NIH/3T3 42
2.2.4. Иммуноцитохимическое выявление белков в клетках NIH/3T3 после фиксации 70%-ным этанолом 43
2.2.5. Выявление мест синтеза рибосомной РНК в клетках NIH/3Т3 43
2.2.6. Флуоресцентная гибридизация in situ на клетках NIH/3Т3 44
2.2.7. Гормональная стимуляция мышей и выделение GV ооцитов 45
2.2.8. Прижизненное окрашивание GV ооцитов Hoechst 33342 45
2.2.9. Окрашивание GV ооцитов акридиновым оранжевым 2.2.10. Окрашивание выделенных ооцитов пиронином Y 46
2.2.11. Окрашивание ооцитов красителем ФИТЦ 46
2.2.12. Иммунофлуоресцентное мечение ооцитов после фиксации ПФА и обработки протеиназой К 47
2.2.13. Визуализация транскрипции путем микроинъекций в ооциты Бр-УТФ 47
2.2.14. Флуоресцентная гибридизация in situ GV ооцитов 49
2.2.15. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 50
3. Результаты 51
3.1. Использование клеток NIH/3Т3 для оптимизации условий использования флуоресцентных красителей, антител к ядрышковым белками и зондов к ядрышковой РНК 51
3.1.1. Окрашивание клеток РНК-связывающим красителем акридиновым оранжевым 51
3.1.2. Окрашивание клеток флуоресцентным РНК-связывающим красителем пиронином Y 51
3.1.3. Использование ФИТЦ – флуоресцентного красителя для выявления белков 53
3.1.4. Оптимизация условий выявления белков антителами без обработки и после демаскирования антигенов протеиназой К 53
3.1.5. Визуализация транскрипции РНК полимеразы I в соматических клетках с помощью Бр-УТФ 55
3.1.6. Оценка специфичности олигонуклетидных зондов к рРНК и мякРНК в фибробластах NIH/3T3
3.2. Определение типа GV ооцитов мыши с помощью ДНК-связывающего красителя 57
3.3. Цитохимическое выявление РНК в GV ооцитах мыши 58
3.4. Выявление белкового компонента в GV ооцитах мыши с помощью ФИТЦ 62
3.5. Иммуноцитохимическое выявление белков ядрышка в GV ооцитах мыши 65
3.6. Выявление мест синтеза первичных транскриптов пре-рРНК с помощью Бр-УТФ в GV ооцитах 69
3.7. Выявление рРНК и мякРНК в GV ооцитах мыши методом FISH 75
4. Обсуждение 80
4.1. Влияние способа фиксации на выявление макромолекул в ЯПТ 80
4.2. Ядрышковые компоненты ЯПТ 83
4.3. Особенности состава ЯПТ ооцитов NSN- и SN-типов
5. Заключение 90
6. Выводы 93
7. Список литературы
