Введение
1. Обзор литературы 13
1.1. Характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток 13
1.1.1. Локализация и тканевые (физиологические) ниши ММСК 13
1.1.2. Особенности ММСК, культивируемых при разном содержании
1.1.2.1. Жизнеспособность 15
1.1.2.2. Иммунофенотип и морфология 16
1.1.2.3. Пролиферация 17
1.1.2.4. Дифференцировка 18
1.1.2.5. Энергетический метаболизм 19
1.2. Влияние окислительного стресса на свойства ММСК 20
1.2.1. Моделирование окислительного стресса in vitro 21
1.2.2. Механизмы действия АФК 23
1.2.3. Антиоксидантная система защиты клетки 28
1.2.4. Механизмы поддержания устойчивости ММСК к окислительному стрессу 32
1.3. Роль HIF в функционировании ММСК, культивируемых при разном содержании О 2 33
2. Материалы и методы 36
2.1 Используемое оборудование, материалы и реактивы 36
2.2 Приготовление сред для культивирования ММСК
2.2.2 Приготовление ростовой среды 38
2.2.3 Приготовление среды для криоконсервации клеток 38
2.3 Получение и культивирование ММСК из жировой ткани человека 38
2.3.1 Получение первичных культур ММСК и их дальнейшее культивирование 38
2.3.2 Культивирование ММСК в условиях пониженного содержания кислорода 39
2.3.3 Криоконсервация культивируемых ММСК
3 2.4 Моделирование окислительного стресса с помощью перекиси водорода 40
2.5 Приготовление лизатов ММСК для оценки ферментативной активности 40
2.6 Характеристика ММСК из жировой ткани человека
2.6.1 Оценка жизнеспособности клеток 40
2.6.2 Функционирование прооксидантной системы клеток
2.6.2.1 Содержание в клетках активных форм кислорода 41
2.6.2.2 Содержание в ММСК ТБК-активных продуктов 42
2.6.3 Функционирование антиоксидантной системы ММСК
2.6.3.1 Определение активности каталазы 42
2.6.3.2 Определение активности супероксиддисмутазы 42
2.6.3.3 Определение активности глутатионпероксидазы 43
2.6.4 Оценка функционального состояния митохондрий ММСК
2.6.4.1 Выявление митохондрий и характеристика их трансмембранного потенциала 43
2.6.4.2 Оценка интенсивности дыхания ММСК 44
2.6.4.3 Определение уровня АТФ 44
2.7 Определение уровня экспрессии генов в ММСК 45
2.7.1 Выделение тотальной РНК, обратная транскрипция 45
2.7.2 Определение уровня экспрессии генов, ассоциированных с гипоксией и окислительным стрессом 46
2.7.3 Определение уровня экспрессии генов HIFla и HIF3a 46
2.8 Статистическая обработка результатов 47
3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Характеристика ММСК при культивировании в условиях различного содержания кислорода (20%, 5%, 1%) 48
3.1.1. Жизнеспособность 48
3.1.2. Активность прооксидантной системы
3.1.2.1. Содержание АФК 49
3.1.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов 53
3.1.3. Функционирование антиоксидантной системы. Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы 54
3.1.4. Функциональное состояние митохондрий ММСК 55
3.1.4.1 Характеристика трансмембранного потенциала 5 5
3.1.4.2 Интенсивность дыхания 57
3.1.4.3 Уровень АТФ 59
3.1.5. Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов 61
3.2. Влияние на ММСК кратковременного изменения содержания кислорода 67
3.2.1. Жизнеспособность 67
3.2.2. Активность прооксидантной системы
3.2.2.1. Содержание АФК 68
3.2.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов 70
3.2.3. Функционирование антиоксидантной системы.
Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы 72
3.2.4. Функциональное состояние митохондрий 76
3.2 4.1. Характеристика трансмембранного потенциала 76
3.2.4.2 Интенсивность дыхания 79
3.2.5. Экспрессия генов HIF-la и HIF-3a 82
3.2.6. Экспрессия гипоксия-ассоциированных генов 85
3.3. Влияние Н202 на ММСК
3.3.1. Жизнеспособность 87
3.3.2. Активность прооксидантной системы
3.3.2.1. Содержание АФК 89
3.3.2.2. Содержание ТБК-активных продуктов 90
3.3.3. Функционирование антиоксидантной системы.
Активность каталазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы 91
3.3.4. Экспрессия генов, связанных с окислительным стрессом 93
Заключение 96
Выводы 98
Список литературы
