Введение
Глава I. Одномолекулярные методы исследования ДНК. Создание экспериментальной установки . 9
1.1 ДНК. 9
1.2 Одномолекулярные методы исследования ДНК 14
1.2.1. Tethered-particle motion (TPM). 15
1.2.2. Метод магнитного захвата. 17
1.2.3. Метод акустической силовой спектроскопии (Acoustic force spectroscopy, AFS). 18
1.2.4. Атомно-силовая микроскопия (АСМ). 19
1.2.5. Флуоресцентная микроскопия. 21
1.2.6. Метод оптического захвата. 23
1.2.6.1. Физический принцип 24
1.2.6.2. Измерение сил 28
1.2.6.3. Экспериментальные схемы использования метода оптического захвата для одномолекулярных исследований ДНК 28
1.3 Материалы и методы 32
1.3.1 Модернизация установки “Лазерный пинцет” 33
1.3.2 Реализация комбинации методов оптического захвата и флуоресцентной микроскопии 40
1.3.3. Определение положения объекта в оптической ловушке 42
1.3.4 Четырехканальная проточная камера для проведения одномолекулярных экспериментов 46
1.3.5 Приготовление модифицированных ДНК субстратов 50
Глава II. Особенности взаимодействия ДНК с красителями YOYO-1 и GelRed 53
2.1. Интеркалирующие красители ДНК 53
2.1.1. ДНК интеркаляторы 54
2.1.2. YOYO-1 56
2.1.3. GelRed з
2.2 Исследование взаимодействия YOYO-1 с ДНК 58
2.2.1. Подготовка проточной камеры 59
2.2.2. Приготовление и подача растворов 59
2.2.3. Протокол проведения эксперимента по манипуляции одиночными молекулами ДНК, окрашенными YOYO-1 61
2.2.4. Динамика изменения длины ДНК при взаимодействии с YOYO-1 66
2.3. Исследование взаимодействия GelRed с ДНК 69
2.4. Заключение по результатам исследований взаимодействия красителей YOYO-1 и GelRed с ДНК 72
Глава III. Особенности взаимодействия ДНК с белком TIP49a . 74
3.1 Обзор литературы по белку TIP49a 74
3.2. Взаимодействия ДНК с TIP49a 78
3.2.1. Протокол экспрессии, выделения и очистки белка TIP49a 78
3.2.2. Исследование взаимодействия ДНК с TIP49a 81
Глава IV. Особенности взаимодействия белка RecA с ДНК 86
4.1. Обзор литературы по белку RecA 86
4.1.1. Гомологическая рекомбинация 87
4.1.2. RecA 89
4.1.3. Одномолекулярные исследования гомологической рекомбинации 92
4.2. Влияние белка RecX (E. coli) на динамику взаимодействия ДНК с RecA (E.
coli) 93
4.2.1. Калибровка жесткости оптической ловушки 95
4.2.2. Исследование влияния белка RecX (E. coli) на динамику взаимодействия ДНК с RecA (E. coli) 99
4.3. Взаимодействие ДНК с RecA (D.radiodurans) 104
4.3.1. Исследование взаимодействия ДНК с RecA (D.radiodurans) 106
Заключение 113
Список публикаций по теме диссертации 114
Список литературы 117
