Введение
Обзор литературы 8
1. Синтез пурпновых нуклеотидов у Escherichia coli 8
1.1. Синтез пуриновых нуклеотидов de novo 9
1.2. Взаимопревращения пуриновых нуклеотидов 12
1.3. salvage путь биосинтеза пуриновых нуклеотидов 14
2. Бактериальная цитоплазматичсская мембрана и мембранные белки 16
2.1. Строение и функции цитоплазматической мембраны 16
2.2. Мембранные белки 19
2.2.1. Пространственная структура мембранных белков 19
2.2.2. Функции мембранных белков 21
2.3. Перенос различных веществ через цитоплазматическую мембрану и
транспортные белки 23
2.3.1. Виды транспорта 23 2.3.1.1.Простая и облегченная диффузия 24 2.3.1.2.Первичные активные транспортеры 24 2.3.1.3.Вторичные активные транспортеры 26 2.3.1 АТранспортные системы с транслокацией группы 28
2.3.2. Классификация транспортных белков 29
3. Транспорт предшественников нуклеиновых кислот в клетку Escherichia coli 31
3.1. Транспорт через внешнюю мембрану 31
3.2. Транспорт нуклеозидов через цитоплазматическую мембрану 32
3.2.1. Системы транспорта нуклеозидов в клетку 32
3.2.2. Регуляция транспорта нуклеозидов 34
3.2.3. Источники энергии для транспорта нуклеозидов 37
3.3. Транспорт оснований 37
4. Экскреция различных веществ из клеток бактерий 38
4.1. Системы множественной лекарственной устойчивости -MDR транспортеры у Escherichia coli 38
4.1.1. Классификация MDR транспортеров 40
4.1.2. Системы экспорта антимикробных агентов 42 4.1.3. Регуляция экспрессии MDR транспортеров 46
4.1.3.1. Локальные регуляторы 47
4.1.3.2. Двухкомпонентные регуляторные системы 49 4.1.3.2. Глобальные регуляторы 49
4.2. Экскреция аминокислот из клеток бактерий 53
4.2.1. Экскреция аминокислот у Corynebacterium glutamicum 54
4.2.2. Экскреция аминокислот у Escherichia coli 57
4.3. Экскреция углеводов у Escherichia coli 63
4.4. Экскреция производных пуринов и пиримидинов 66
4.4.1. Экскреция пуриповых производных у Bacillus subtilis 66
4.4.2. Накопление клетками Escherichia coli продуктов деградации нуклеиновых кислот 68
Материалы и методы 71
1. Бактериальные штаммы, фаги, плазмиды, олигонуклеотиды и среды 71
2. Методы работы с ДНК 76
3. Проведение полимеразной цепных реакций (ПЦР) 76
4. Определение точки начала транскрипции 76
5. Трансформация, трансдукция, электротрансформация и интеграция в хромосому Е. coli 77
6. Определение минимальных ингибирующих концентраций (МИК) 78
7. Трансформация штамма Bacillus subtilis 168 и трансдукция фагом Е40 78
8. Определение скорости экскреции инозина 80
9. Проведение ферментации в пробирках со штаммами-продуцентами Е. coli 81
10. Проведение ферментации в пробирках со штаммом-продуцентом Bacillus amyloliquefaciens A J1991 81
11. Определение активности р-галактозидазы 82
Результаты и обсуждение 83
1. Поиск и идентификация генов, амплификация которых обеспечивает устойчивость Е. coli к аналогам пуриновых оснований 83
1.1. Идентификация генов ydeD и yijE, обеспечивающих устойчивость к 8-азааденину 83
1.2. Влияние амплификации генов ydeD, yijE и rhtA на устойчивость клеток Е. coli к 8-азааденину и продукцию инозина соответствующим штаммом- продуцентом 85
1.3. Влияние амплификации генов ydeD, yijE и rhtA на продукцию инозина штаммом-продуцентом Е. coli 86
2. Идентификация гена yicM и компьютерный анализ кодируемого им белка 87
2.1. Поиск генов Е. coli, амплификация которых обеспечивает устойчивость
к инозину и/или гуанозину штамма GS72 87
2.2. Определение сайтов инициации транскрипции и трансляции гена yicM 89
2.3. YicM - мембранный белок, относящийся к MFS транспортерам 91
3. Исследование участия YicM в экскреции пурииовых иуклеозидов из
клеток Е. coli 92
3.1. Влияние инактивации и сверхэкспрессии гена yicM на устойчивость клеток Е. coli к пуриновым нуклеозидам и аналогам 92
3.2. Сверхэкспрессия гена yicM снижает скорость роста Е. coli на минимальных средах, содержащих пуриновые рибонуклеозиды в качестве единственных источников углерода и энергии 96
3.3. Сверхэкспрессия гена yicM приводит к накоплению инозина в культуралыюй среде штаммом Е. coli с инактивированной пурин нуклеозидфосфорилазой 99
3.4. Сверхпродукция YicM снижает индукцию внутреннего промотора deoP3 оперона deoCABD пуриновыми нуклеозидами 100
3.5. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на скорость экскреции инозина из клеток Е. coli и зависимость этой экскреции от присутствия протонофора карбонилцианида-т-хлорфенилгидразона (СССР) 102
3.6. Влияние сверхэкспрессии гена yicM на продукцию пурииовых производных штаммами-продуцентами Е. coli 104
3.7. Сверхэкспрессия yicM в клетках Bacillus amyloliquefaciens увеличивает накопление пурииовых иуклеозидов штаммом-продуцентом 106
4. Исследование регуляции экспрессии гена yicM 109
4.1. Влияние состава питательной среды на экспрессию гена yicM 109
4.2. Изучение влияния фазы роста на экспрессию гена yicM 111
4.3. Изучение влияния аллельного состояния гена rpoS на экспрессию гена 112
4.4. Изучение экспрессии гена уісМ в условиях теплового и осмотического шока 113
4.5. Изучение влияния различных веществ на уровень экспрессии гена уісМ 114
Заключение 116
Выводы 119
Список литературы
