Введение
1 Обзор литературы 16
1.1 Образование биопленок у бактерий 16
1.1.1 Биопленки S. aureus 27
1.1.2 Биопленки P. aeruginosa 30
1.2 Полимикробные биопленки 33
1.3 Способы терапии бактериальных биопленок 38
Заключение 45
Экспериментальная часть 47
2 Материалы и методы исследования 47
2.1 Антибактериальные вещества, использованные в работе 47
2.2 Линии клеток и условия культивирования 47
2.3 Методы работы с бактериальными клетками 47
2.3.1 Штаммы 47
2.3.2 Плазмидные векторы 49
2.3.3 Среды и условия культивирования 49
2.3.4 Определение способности бактерий образовывать биопленки (с модификациями) 50
2.3.5 Получение смешанной биопленки 51
2.3.6 Определение минимальной подавляющей концентрации и минимальной бактерицидной концентрации 51
2.3.7 Определение минимальной концентрации, подавляющей образование биопленок 51
2.3.8 Определение эффективности антимикробных веществ против бактерий в составе биопленок 52
2.3.9 Подсчет КОЕ 52
2.3.10 Трансформация клеток E. coli методом теплового шока 52
2.3.11 Трансформация клеток S. aureus методом электропорации 53
2.4 Методы работы с рекомбинантной ДНК 53
2.4.1 Выделение геномной ДНК бацилл методом фенол-хлороформной экстракции 53
2.4.2 Выделение геномной ДНК S. aureus с помощью GenElute Bacterial Genomic DNA Kits 54
2.4.3 Выделение плазмидной ДНК с помощью GeneJET Plasmid Miniprep Kit 54
2.4.4 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 55
2.4.5 Очистка амплифицированных фрагментов ДНК после ПЦР 56
2.4.6 Рестрикция ДНК 56
2.4.7 Реакция Гибсона 56
2.4.8 Электрофорез ДНК 56
2.5 Схемы получения рекомбинантных конструкций 57
2.5.1 Клонирование гена sacC из B. subtilis 168 для получения гиперпродуцентов рекомбинантной леваназы SacCst 57
2.5.2 Получение рекомбинантного штамма S. aureus ica-GFP, экспрессирующего зеленый флуоресцентный белок с промотора гена icaA 57
2.6 Методы работы с белками 58
2.6.1 Скрининг рекомбинантных штаммов, обеспечивающих гиперпродукцию белка58
2.6.2 Гиперпродукция белков в клетках E. coli и получение клеточных экстрактов 58
2.6.3 Очистка белков на стреп-тактин сефарозе 59
2.7 Микроскопические методы исследований 60
2.7.1 Флуоресцентная микроскопия 60
2.7.2 Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия 60
2.7.3 Атомно-силовая микроскопия 61
2.8 Методы исследований биобезопасности веществ 61
2.8.1 Определение цитотоксичности 61
2.8.2 Тест Эймса 62
2.8.3 Тест Эймса с метаболической активацией 63
2.8.4 ДНК-повреждающий тест 64
2.9 Определение активности -галактозидазы 64
2.10 Статистическая обработка результатов 65
3 Результаты исследований 66
3.1 Подавление образования бактериальных биопленок производными 2(5H)-фуранона 66
3.1.1 Подбор питательных сред 66
3.1.2 Скрининг производных 2(5Н)-фуранона, подавляющих образование биопленок клетками грамположительных и грамотрицательных бактерий 67
3.1.3 Повышение эффективности антибиотиков в присутствии фуранонов 69
3.1.4 Цитотоксичность производных 2(5H)-фуранона 73
3.1.5 Мутагенность соединения Ф105 74
3.2 Разрушение биопленок P. aeruginosa с помощью бактериальных гликозидгидролаз 76
3.2.1 Клонирование гена внеклеточной леваназы SacС из B.subtilis, очистка белка 76
3.2.2 Оценка эффективности разрушения биопленок P. aeruginosa внеклеточной леваназой SacCst 78
3.2.3 Исследование возможности повышения эффективности антибиотиков в присутствии внеклеточной леваназы SacCst против клеток P. aeruginosa в составе биопленки 79
3.3 Исследование устойчивости бактерий в составе полимикробных биопленок 82
3.3.1 Моделирование полимикробной биопленки S. aureus и P. aeruginosa 82
3.3.2 Атомно-силовая микроскопия полимикробных биопленок 88
3.3.3 Влияние различных групп антибиотиков на S. aureus и P. aeruginosa в составе смешанной биопленки 90
3.3.4 Оценка эффективности антибиотиков широкого спектра действия в присутствии внеклеточной леваназы SacCst на микроорганизмы в составе смешанной биопленки S. aureus и P. aeruginosa 98
3.3.5 Анализ образования малых форм колоний S. aureus при терапии смешанных биопленок S. aureus-P. aeruginosa 99
3.3.6 Анализ воздействия цианида, синтезируемого P. aeruginosa, на жизнеспособность S. aureus в смешанной биопленке 100
3.3.7 Интродукция бактерий-антагонистов как способ повышения антимикробной эффективности антибиотиков 101
4 Обсуждение результатов 103
Заключение 112
Список использованных источников 114
Приложение 1 142
Приложение 2 153
