Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 9
1.1. Хитозан – уникальный полимер для биомедицины 9
1.2. Источники получения и основные физико-химические характеристики хитозана 10
1.2.1 Биодеградируемость 12
1.2.2.Биосовместимость 13
1.2.3 Токсичность 14
1.3. Влияние основных физико-химических характеристик хитозана (ММ, СД) на растворимость при рН 5.5-7.4. 16
1.3.1. Влияние СД на растворимость хитозана. 17
1.3.2 Влияние ММ хитозана на растворимость и способы её снижения
1.4 Водорастворимые производные хитозана, получение и применение в биомедицине 20
1.4.1.Карбоксиметилирование 21
1.4.2. Сукцинилирование 24
1.4.3. Сульфатирование 28
1.4.4. Гликозилирование 31
1.4.5. Тиолирование 33
1.4.6. Кватернизирование 35
ГЛАВА II. Экспериментальная часть 44
2.1 Реагенты и растворители 44
2.2 Лабораторное оборудование 45
2.3 Кислотный гидролиз хитозана 46
2.4 Синтез производных низкомолекулярного хитозана
2.4.1 Синтез ацилированных производных хитозана 46
2.4.2 Синтез алкилированных производных хитозана с различными степенями замещения 47 2.4.3 Синтез производных хитозана с двумя группами (алкилированные и
ацилированные) 47
2.5 Физико-химическая характеристика хитозана и его производных 48
2.5.1 Определение степени дезацетилирования и степени замещения НМХ и его производных методом протонного магнитного резонанса (1Н-ЯМР) 48
2.5.2 Определение молекулярной массы хитозана с помощью высокоэффективной гель-проникающей хроматографии 48
2.5.3 Определение степени замещения производных хитозана 49
2.5.4 ИК-спектроскопия 49
2.5.5 Определение растворимости хитозана и его алкилированных производных. 49
2.5.6 Установление зависимости растворимости производных хитозана от рН. 50
2.5.7 Измерение размера и -потенциала хитозана и его производных 50
2.5.8 Ферментативная деградация производного КвХ98 50
2.6 Формирование частиц и конъюгатов производных хитозана с пептидами
2.6.1Формирование частиц алкилированных производных 51
2.6.2 Формирование частиц N-сукцинил хитозана 51
2.6.2.1 Сорбция варнерина на частицы сукцинил хитозана 52
2.6.3 Синтез конъюгатов из алкилированных производных с варнерином и мелиттином 52
2.6.3.1 Очистка препарата трансглутаминазы 53
2.6.3.2 Определение структуры конъюгатов 53
2.6.3.3 Определение количества пептида в конъюгате. 53
2.6.4 Атомно-силовая микроскопия 53
2.7 Изучение биологических активностей хитозана, производных хитозана, коньюгатов 54
2.7.1 Изучение антибактериальной активности хитозана и его производных, конъюгатов и частиц производных хитозана 54
2.7.2 Изучение совместного действия алкилированных производных хитозана с лизостафином и варнерином на клетки стафилококков 2.7.3 Изучение антиоксидантной активности алкилированных производных 55
2.7.4 Изучение хелатирующей способности алкилированных производных 56
2.8 Изучение внутриклеточного транспорта алкилированных производных
2.8.1 Получение ФИТЦ-меченных производных хитозана 56
2.8.2 Цитотоксичность производных хитозана 56
2.8.3 Определение эффективности связывания и проникновения препаратов в клетку методом проточной цитометрии 57
2.8.4 Конфокальная микроскопия 58
2.9 Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации антикоагулянтной активности гепаринов в системах in vitro, in vivo 58
2.9.1 Подготовка крови и плазмы. 58
2.9.2 Гемолиз эритроцитов при действии алкилированных производных хитозана 59
2.9.3 Влияние алкилированных производных хитозана и СПТ на агрегацию тромбоцитов 59
2.9.4 Нейтрализация антитромбиновой активности НФГ алкилированными производными хитозана и СПТ 60
2.9.5 Нейтрализация активности НМГ клексана по отношению к фактору Ха алкилированными производными хитозана и СПТ 60
2.9.6 Влияние внутривенного введения производных хитозана на антикоагулянтную активность плазмы гепаринизированных морских свинок 61
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение 63
3.1 Получение низкомолекулярного хитозана 63
3.2 Синтез алкилированных и ацилированных производных НМХ 64
3.3 Физико-химическая характеристика хитозана и его производных 66
3.3.1.Спектральные характеристики хитозана и его производных 66
3.3.2 Растворимость и заряд алкилированных производных хитозана 67
3.3.3. Ферментативная деградация КвХ98 3.4 Формирование частиц и конъюгатов с производными хитозана 70
3.4.1 Получение частиц на основе алкилированных производных хитозана методом ионотропного гелеобразования 71
3.4.2 Получение частиц на основе сукцинил хитозана 73
3.4.3 Предварительная очистка варнерина и сорбция его на частицы сукцинил хитозана 74
3.4.4 Физико-химические характеристики загруженных частиц 75
3.4.5 Формирование конъюгатов алкилированных производных с варнерином и мелиттином 76
3.5 Исследование биологических свойств хитозана, производных хитозана и коньюгатов на их основе. 78
3.5.1 Антибактериальное действие хитозана и его производных 78
3.5.2 Антиоксидантная активность алкилированных производных 81
3.5.3 Хелатирующая способность алкилированных производных 82
3.5.4 Антибактериальное действие частиц и коньюгатов 84
3.5.4.1 Изучение антибактериального действия коньюгатов пептидов и кватернизированного производного хитозана с помощью атомно силовой микроскопии 84
3.5.5 Совместное действие алкилированных производных хитозана с лизостафином и варнерином на клетки стафилококков 89
3.6 Изучение взаимодействия алкилированных производных с клетками млекопитающих 92
3.6.1 Токсичность алкилированных производных 92
3.6.2 Исследование взаимодействия алкилированных производных с клеткой методом проточной цитометрии 94
3.6.3 Визуализация взаимодействия алкилированных производных с клеткой методом конфокальной микроскопии 96
3.7 Исследование взаимодействия алкилированных производных хитозана с компонентами крови и оценка их способности к нейтрализации антикоагулянтной активности препаратов гепарина в системах in vitro, in vivo . 98
3.7.1 Гемолиз эритроцитов 98
3.7.2 Агрегация тромбоцитов 100
3.7.3 Оценка прокоагулянтного действия алкилированных производных и СПТ при нейтрализации активности НФГ и НМГ 101
3.7.4 Оценка нейтрализации алкилированными производными антикоагулянтной активности плазмы морских свинок в результате введения НФГ или НМГ 105
Выводы 110
Заключение 111
Список сокращений 112
Список работ, опубликованных по теме диссертации благодарности 117
Список литературы 118
