ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ .................................. 5
ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 7
Актуальность темы диссертационного исследования ............................................. 7
Степень разработанности темы .................................................................................. 9
Цель исследования ..................................................................................................... 10
Задачи исследования ................................................................................................. 10
Научная новизна ........................................................................................................ 11
Теоретическая и практическая значимость ............................................................. 11
Методология и методы исследования ..................................................................... 12
Положения, выносимые на защиту .......................................................................... 12
Степень достоверности результатов ........................................................................ 13
Апробация результатов исследования ..................................................................... 14
Соответствие диссертации паспорту научной специальности ............................. 15
Личный вклад автора в проведение исследования ................................................. 15
Публикации ................................................................................................................ 15
Структура и объем диссертации .............................................................................. 16
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................... 17
1.1 Муковисцидоз .................................................................................................. 17
1.1.1 Определение и эпидемиология муковисцидоза ......................................... 17
1.1.2 Молекулярно-генетические аспекты патогенеза муковисцидоза ............ 18
1.1.3 Терапия муковисцидоза ................................................................................ 20
1.2 Клеточные модели муковисцидоза .................................................................... 24
1.2.1 Иммортализованные клеточные линии ....................................................... 24 1.2.2 Первичные клеточные культуры ................................................................. 25
1.2.3 Клеточные модели респираторного эпителия человека, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток ...................................... 32
1.3 Заключение ........................................................................................................... 40
3
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ...................................................................... 43
2.1 Материалы исследования .................................................................................... 43
2.2 Методы исследования ......................................................................................... 44
2.2.1 Получение и культивирование чиПСК ....................................................... 44
2.2.2 Получение и культивирование бронхиальных и легочных органоидов из чиПСК ...................................................................................................................... 45
2.2.3 Получение и культивирование базальных клеток респираторного эпителия из чиПСК ................................................................................................ 50
2.2.4 Получение и культивирование легочных органоидов из чиБК ................ 52
2.2.5 Получение и культивирование первичных культур назальных эпителиальных клеток............................................................................................ 53
2.2.6 Цилиогенез in vitro ........................................................................................ 53
2.2.7 Анализ клеточного индекса .......................................................................... 54
2.2.8 Иммунофлуоресцентное окрашивание ....................................................... 54
2.2.9 Световая и флуоресцентная микроскопия .................................................. 57
2.2.10 Конфокальная микроскопия ....................................................................... 57
2.2.11 Проточная цитофлуориметрия ................................................................... 57
2.2.12 Выделение ДНК и определение концентрации ........................................ 58
2.2.13 Выделение РНК и определение концентрации ........................................ 58
2.2.14 Обратная транскрипция .............................................................................. 58
2.2.15 Полимеразная цепная реакция ................................................................... 58
2.2.16 Полимеразная цепная реакция в реальном времени ................................ 59
2.2.17 Электрофорез нуклеиновых кислот .......................................................... 61
2.2.18 Молекулярно-генетический анализ комплексного аллеля гена CFTR .. 61
2.2.19 Массовое параллельное секвенирование гена CFTR .............................. 62
2.2.20 Форсколин-индуцированное набухание бронхиальных и легочных органоидов............................................................................................................... 63
2.2.21 Доставка генетических конструкций в чиБК методом электропорации 65
2.2.22 Доставка генетических конструкций в чиБК методом липофекции ..... 66
4
2.2.23 Оценка жизнеспособности клеток после невирусной доставки генетических конструкций .................................................................................... 67
2.2.24 Анализ изображений ................................................................................... 68
2.2.25 Статистический анализ ............................................................................... 69
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ ............................................................ 70
3.1 Бронхиальные и легочные органоиды из чиПСК ............................................. 70
3.1.1 Получение бронхиальных и легочных органоидов ................................... 70
3.1.2 Пассирование и криоконсервация органоидов .......................................... 76
3.1.3 Анализ площади органоидов ........................................................................ 77
3.1.4 Характеристика клеточного состава органоидов ....................................... 79
3.2 Базальные клетки респираторного эпителия из чиПСК .................................. 84
3.2.1 Получение базальных клеток респираторного эпителия из чиПСК ........ 84
3.2.2 Характеристика базальных клеток респираторного эпителия из чиПСК 87
3.3 Получение и характеристика легочных органоидов из чиБК ......................... 92
3.4 Форсколин-индуцированное набухание бронхиальных и легочных органоидов из чиПСК ................................................................................................ 94
3.5 Форсколин-индуцированное набухание легочных органоидов из чиПСК и чиБК в ответ на модуляторы CFTR-канала ........................................................... 100
3.6 Доставка генетических конструкций в чиБК .................................................. 109
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 118
ВЫВОДЫ ..................................................................................................................... 120
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ..................................................................... 122
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ........................................ 123
Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России ............................................................................................... 123
Список публикаций в других изданиях ................................................................. 125
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ........................................................................................... 127
