Введение
1. Обзор литературы 10
1. Краткая характеристика F. tularensis 10
1.1. Распространение и эпидемиология 10
1.2. Биологические свойства 12
1.2.1. Классификация рода Franclsolla 12
1.2.2. Морфология и культуральные свойства 13
1.2.3. Биохимические свойства 15
1.2.4. Основные факторы патогенное 15
1.2.5. Основные антигенные детерминанты F. tularensis 16
2. Профилактика туляремии 20
2.1. Живые вакцины 2 0
2.2. Инактивированные вакцины 23
2.3. Рекомбинантные живые вакцины 25
2.4. ДНК вакцины 26
2.5. Субъединичные генно-инженерные вакцины 27
3. Использование технологии химерных белков для создания субъединичных генно-инженерных вакцин 29
3.1. Целлюлозосвязывающий домен 33
3.2. Применение целлюлозы как иммуносорбента 35
CLASS 2. Материалы и методы 3 CLASS 7
1. Материалы 37
1.1. Бактериальные штаммы 3 7
1.2. Плазмидные векторы 37
1.3. Олигонуклеотиды 37
1.4. Ферменты и другие реактивы 38
1.5. Лабораторные животные 38
2.1. Выделение хромосомной ДНК 38
2.2. Выделение и очистка аналитических количеств плазмиднои ДНК 39
2.3. Вьщеление и очистка препаративных количеств плазмиднои ДНК 4 0
2.4. Гидролиз ДНК специфическими зндонуклеазами 41
2.5. Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле 41
2.6. Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция их из геля 42
2.7. Лигирование фрагментов ДНК 42
2.8. Трансформация клеток Е. coll 42
2.8.1. Подготовка компетентных клеток 42
2.8.2. Электропорация 43
2.9. Полимеразная цепная реакция 43
2.10. Определение нуклеотидной последовательности ДНК 44
2.11. Электрофорез белков в ПААГ-ДСН (PAGE - SDS) 44
2.12. Выращивание штамма-продуцента и индукция синтеза рекомбинантных белков 45
2.13. Определение локализации белков в лизатах штамма-продуцента 46
2.14. Иммобилизация и выделение белков, содержащих целлюлозосвязывающий домен 46
2.15. Иммунизация лабороторных животных 47
2.16. Иммуноблоттинг 47
3. Результаты и обсуждение 48
1. Создание бактериальных штаммов-продуцентов белка TUL4 из Г. tularensis 48
1.1. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию и секрецию белка TUL4 в периплазму клеток Е. coli 49
1.1.1. Клонирование гена белка TUL4 51
1.1.1.1. Получение ПЦР фрагментов гена белка TUL4 51
1.1.1.2. Клонирование гена белка TUL4 в векторе pGEM-T 58
1.1.1.3. Секвенированиє нуклеотидных последовательностей гена белка TUL4 59
1.1.2. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка TUL4 62
1.1.3. Создание бактериальных продуцентов белка TUL4 64
1.2. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию белка TUL4 в цитоплазме клеток Е. coli 65
1.2.1. Создание экспрессионного вектора, содержащего ген зрелого белка TUL4 65
1.2.2. Создание бактериального продуцента гена зрелого белка TUL4 67
1.3. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего экспрессию химерного белка TUL4-CBD в цитоплазме клеток Е. coli 68
1.3.1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка TUL4 в составе химерной конструкции с целлюлозосвязывающим доменом. 68
1.3.2. Создание бактериальных продуцентов генов белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD 72
2. Оптимизация экспрессии химерных белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD 73
2.1. Оптимизация времени индукции 73
2.2. Оптимизация индукции с помощью плазмиды pACYC-RIL 74
2.3. Индукция белков CBD-sp-TUL и TUL4-sp-CBD в различных штаммах Е. coli 76
3. Изучение локализации химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD в лизатах штамма Е. coli DH5a 78
4. Выделение и очистка белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-sp-CBD 79
4.1. Изучение связывания химерных белков CBD-sp-TUL4 и TU"L4-sp-CBD с различными видами целлюлозы 79
4.2. Выделение и очистка химерных белков CBD-sp-TUL4 и TUL4-SP-CBD 80
5. Определение антигенных свойств белка TUL4-sp-CBD 83
5.1. Получение кроличьих антисывороток к комплексу тиіі4-р-СВ0-целлюлоза 83
5.2. Исследование антигенных свойств 83
Выводы 86
