ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................... 9
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ...................................................................................... 15
1.1 Тканевая инженерия и регенеративная медицина .................................................. 15
1.1.1. Трансплантология и проблема дефицита донорских органов .................... 15
1.1.2. Подходы к решению проблемы дефицита органов...................................... 17
1.1.2.1. Клеточная терапия ....................................................................................... 17
1.1.2.2. Ксенотрансплантация .................................................................................. 18
1.1.2.3. Стратегии рецеллюляции............................................................................ 18
1.1.3. Проблемы и ограничения, связанные с тканевой и органной
биоинженерией............................................................................................................. 19
1.1.3.1. Картирование................................................................................................ 19
1.1.3.2. Источники клеток ........................................................................................ 20
1.1.3.3. Иммуносупрессия ........................................................................................ 21
1.1.3.4. Интеграция.................................................................................................... 22
1.1.3.5. Васкуляризация............................................................................................ 22
1.1.4. Триада тканевой инженерии........................................................................... 23
1.1.4.1. Стволовые клетки ........................................................................................ 23
1.1.4.2. Бесклеточная терапия .................................................................................. 25
1.1.4.3. Взрослые стволовые клетки........................................................................ 25
1.2 Полимерные материалы и матриксы на их основе для тканевой инженерии ..... 27
1.2.1 Основные функции естественного внеклеточного матрикса...................... 27
1.2.2 Функции полимерных матриксов и требования к ним ................................ 28
1.2.3 Биоразлагаемые матриксы на основе природных и синтетических
полимеров ..................................................................................................................... 30
1.2.3.1 Матриксы на основе природных материалов ........................................... 31
1.2.3.2 Матриксы на основе синтетических полимеров....................................... 35
1.2.3.3 Композитные матриксы .............................................................................. 36
3
1.3 Формы матриксов для тканевой инженерии ........................................................... 38
1.3.1 Гидрогели как матриксы для тканевой инженерии...................................... 39
1.3.1.1 Общая характеристика гидрогелей ............................................................ 40
1.3.1.2 Классификация гидрогелей по заряду ....................................................... 40
1.3.1.3 Классификация гидрогелей по способу получения ................................. 41
1.3.1.4 Физико-химические свойства гидрогелей................................................. 43
1.4 Свойства хитозана как материала для получения гидрогелей .............................. 44
1.4.1 Физико-химические свойства ......................................................................... 45
1.4.2 Биологические свойства.................................................................................. 45
1.4.3 Механические свойства................................................................................... 46
1.5 Свойства полимолочной кислоты и олиголактидов как материалов для
получения гидрогелей...................................................................................................... 47
1.6 Влияние матриксов на дифференцировку стволовых клеток ............................... 49
1.6.1 Влияние состава матрикса на стволовые клетки.......................................... 50
1.6.2 Влияние эластичности матриксов на стволовые клетки.............................. 51
1.7 Влияние состава среды для культивирования на дифференцировку стволовых
клеток................................................................................................................................. 52
1.8 Влияние механической стимуляции на дифференцировку стволовых клеток.... 52
1.9 Влияние других факторов на дифференцировку стволовых клеток .................... 53
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ............................................................................... 55
2.1.Используемые реактивы............................................................................................ 55
2.2.Подготовка материалов и реактивов к работе с животными клетками................ 56
2.2.1. Приготовление среды для культивирования клеток животных.................. 56
2.2.2. Приготовление сред для дифференцировки мезенхимальных стромальных
клеток 57
2.2.3. Стерилизация.................................................................................................... 57
2.3.Работа с клеточными культурами ............................................................................ 58
2.3.1. Выделение мезенхимальных стромальных клеток из жировой ткани
человека......................................................................................................................... 58
2.3.2. Хранение и размораживание клеток.............................................................. 58
4
2.3.3. Ведение клеточных культур ........................................................................... 59
2.3.4. Исследование иммунофенотипа мезенхимальных стромальных клеток... 60
2.3.5. Замораживание клеток .................................................................................... 61
2.3.6. Световая микроскопия..................................................................................... 62
2.3.7. МТТ-тест........................................................................................................... 62
2.4.Получение гидрогелей и плёночных материалов................................................... 62
2.5.Исследование структуры гидрогелей....................................................................... 63
2.6.Исследование физико-химических свойств гидрогелей........................................ 64
2.6.1. Стерилизация плёночных материалов и гидрогелей.................................... 64
2.6.2. Изучение набухаемости гидрогелей .............................................................. 64
2.6.3. Изучение биодеградации гидрогелей ............................................................ 65
2.6.4. Оценка механических характеристик матриксов ......................................... 65
2.7.Исследование цитотоксичности гидрогелей в модели in vitro.............................. 66
2.8.Оценка риска воспалительной реакции в модели in vitro...................................... 67
2.9.Исследование роста клеток на матриксах ............................................................... 67
2.9.1. Культивирование клеток в гидрогелях.......................................................... 67
2.9.2. Определение количества жизнеспособных клеток после культивирования
в гидрогелях.................................................................................................................. 68
2.9.3. Изучение морфологии и распределения клеток, растущих в гидрогелях.. 69
2.10.Исследование дифференцировки клеток при культивировании на матриксах. 70
2.10.1. Культивирование мезенхимальных стромальных клеток на пленочных
материалах .................................................................................................................... 70
2.10.2. Остеогенная дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток.... 70
2.10.3. Оценка дифференцировки мезенхимальных стромальных клеток по
активности щелочной фосфатазы............................................................................... 71
2.10.4. Адипогенная дифференцировка мезенхимальных стромальных клеток... 71
2.10.5. Оценка адиподифференцировки мезенхимальных стромальных клеток по
наличию жировых накоплений................................................................................... 71
2.10.6. Исследование экспрессии генов остео- и адипогенеза мезенхимальных
стромальных клеток..................................................................................................... 72
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.............................................................. 73
5
3.1.Структура и физико-химические свойства матриксов на основе сополимеров
хитозана с олиголактидами............................................................................................. 73
3.1.1. Структура матриксов....................................................................................... 73
3.1.2. Набухаемость матриксов................................................................................. 76
3.1.3. Биодеградация матриксов ............................................................................... 79
3.1.4. Исследование механических характеристик матриксов.............................. 81
3.2.Исследование цитотоксичности матриксов ............................................................ 87
3.3.Оценка риска воспалительной реакции в модели in vitro...................................... 89
3.4.Культивирование клеток на/в матриксах в модели in vitro ................................... 91
3.4.1. Характеристика фенотипа мезенхимальных стромальных клеток............. 92
3.4.2. Морфология клеток, культивируемых на пленках....................................... 95
3.4.3. Морфология клеток, культивируемых в макропористых гидрогелях........ 96
3.4.4. Рост и пролиферация клеток в макропористых гидрогелях........................ 98
3.5.Исследование дифференцировки клеток при культивировании на пленках..... 101
3.5.1. Остеогенный потенциал мезенхимальных стромальных клеток при
культивировании на плёнках .................................................................................... 101
3.5.2. Адипогенный потенциал мезенхимальных стромальных клеток при
культивировании на пленках .................................................................................... 104
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................................ 109
ВЫВОДЫ.......................................................................................................................... 111
БЛАГОДАРНОСТИ ......................................................................................................... 113
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ....................................................... 114
